一种巨噬细胞上清液条件培养基制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种巨噬细胞上清液条件培养基制备方法及应用，包括以下步骤：步骤一：将THP

【技术实现步骤摘要】
一种巨噬细胞上清液条件培养基制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及巨噬细胞培养基制备
，尤其涉及一种M2a/M2c巨噬细胞上清液条件培养基制备方法及应用。

技术介绍

[0002]巨噬细胞作为炎症反应的主要作用细胞，在不同条件下，有着明显的形态和功能差异，根据活化状态、发挥功能以及分泌因子的不同，巨噬细胞主要可分为经典活化的M1型巨噬细胞和选择性活化的M2型巨噬细胞。
[0003]M1型巨噬细胞一般是通过干扰素
‑
Y及细菌脂多糖(LPS)活化，M1主要分泌促炎因子，在炎症早期承担着重要作用。而M2型巨噬细胞通过Th
‑
2细胞因子如IL
‑
4、I L
‑
13及免疫复合物等进行活化，M2表达抑制炎症因子，起着抑制炎症反应以及组织修复的作用。根据在组织修复中的不同作用，M2型巨噬细胞又可以分为三种亚型，分别为M2a、M2b、M2c。其中M2a、M2b可以起到免疫调节作用及促进M2型免疫反应，而M2c则是有着抑制免疫反应及组织重构的作用。
[0004]然而现有的技术中缺乏对于M2a/M2c巨噬细胞上清液培养基的制备方法，同时也缺乏对制备后培养基的应用，因此提出一种M2a/M2c巨噬细胞上清液条件培养基制备方法及应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种M2a/M2c巨噬细胞上清液条件培养基制备方法及应用。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0007]一种M2a/M2c巨噬细胞上清液条件培养基制备方法及应用，以下步骤：
[0008]步骤一：将THP
‑
1单核细胞接种于六孔板中，在PMA(s igma,100nM)刺激下分化成为M0；
[0009]步骤二：对分化后的M0进行PBS溶液清洗，PBS清洗后更换为新鲜RMPI
‑
1640(10％FBS)培养基培养24h；
[0010]步骤三：将I L
‑
4+IL
‑
13(M2a诱导)、IL
‑
10(M2c诱导)重组蛋白加入至M0细胞中；
[0011]步骤四：细胞清洗后进行Rea l T ime
‑
PCR检测(CD206、CD209/DC
‑
S IGN、CD163、CD16、MerTK，MMPs/TIMPs,PDGF,VEGF，TGF
‑
β1，FGF)检测，得到M2a(CD206+CD209/DC
‑
SIGN+CD163+CD16
‑
Mer receptor tyros i ne k i nase(MerTK)
‑
)细胞及M2c(CD206
‑
CD209/DC
‑
S IGN
‑
CD163+CD16+Mer receptor tyros i ne k i nase(MerTK)+)细胞；
[0012]步骤五：按照步骤一培养M0、M2a、M2c，孵育3天后，将培养基弃去，再向M2a、M2c及M0中加入新鲜α
‑
MEM培养基，24小时后收集条件培养基，从而得到M2a
‑
CM、M2c
‑
CM及M0
‑
CM，M2a
‑
CM与M2c
‑
CM体积1:1混合作为M2a
‑
CM/M2c
‑
CM组
[0013]上述技术方案进一步包括：
[0014]六孔板密度为2
×
106/孔，PMA刺激下的环境为37℃、5％CO2培养24h。
[0015]其中IL
‑
4为(20ng/ml，PeproTech,#200
‑
04)，I L
‑
13为(20ng/ml，PeproTech,#200
‑
13)，I L
‑
10为(40ng/ml,Peprotech,#200
‑
10)。
[0016]将制备的培养基用于培养人牙囊来源间充质细胞，共四组：M2a
‑
CM；M2c
‑
CM；M2a
‑
CM/M2c
‑
CM；M0
‑
CM。
[0017]通过Rea l
‑
t imePCR检测成牙周膜成牙本质相关因子，相关因子包括：Co l
‑
I、DMP
‑
1、DSPP、OPN、RUNX2。
[0018]以M0组为对照组，对M2a
‑
CM；M2c
‑
CM；M2a
‑
CM/M2c
‑
CM三组的线粒体活性数据进行分析。
[0019]本专利技术具备以下有益效果：
[0020]1、本专利技术中，将THP
‑
1单核细胞在PMA(s igma,100nM)刺激下分化成为M0，再将I L
‑
4+IL
‑
13(M2a诱导)、IL
‑
10(M2c诱导)重组蛋白加入至M0细胞中进行培养，从而得到M2a培养基细胞与M2c细胞培养基。
[0021]2、本专利技术中，条件培养基促进牙囊细胞线粒体氧化磷酸化活性，促进牙囊细胞成骨分化、成牙分化，对于牙囊细胞作为牙源性干细胞参与生物牙根再生具有重要意义；
[0022]条件培养基亦可作为诱导间充质干细胞线粒体氧化磷酸化活性的促进剂，避免间充质干细胞线粒体移植的繁琐操作，对于干细胞再生医学研究有重要意义。
具体实施方式
[0023]基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0024]实施例一
[0025]第一步，将THP
‑
1单核细胞接种于六孔板中，六孔板密度为2
×
106/孔，在PMA(s igma,100nM)刺激下分化成为M0，PMA刺激下的环境为37℃、5％CO2培养24h；
[0026]第二步，对分化后的M0进行PBS溶液清洗，PBS清洗后更换为新鲜RMPI
‑
1640(10％FBS)培养基培养24h；
[0027]第三步，将I L
‑
4+IL
‑
13(M2a诱导)、IL
‑
10(M2c诱导)重组蛋白加入至M0细胞中，其中IL
‑
4为(20ng/ml，PeproTech,#200
‑
04)，I L
‑
13为(20ng/ml，PeproTech,#200
‑
13)，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种M2a/M2c巨噬细胞上清液条件培养基制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将THP
‑
1单核细胞接种于六孔板中，在PMA(sigma,100nM)刺激下分化成为M0；步骤二：对分化后的M0进行PBS溶液清洗，PBS清洗后更换为新鲜RMPI
‑
1640(10％FBS)培养基培养24h；步骤三：将IL
‑
4+IL
‑
13(M2a诱导)、IL
‑
10(M2c诱导)重组蛋白加入至M0细胞中；步骤四：细胞清洗后进行RealTime
‑
PCR检测(CD206、CD209/DC
‑
SIGN、CD163、CD16、MerTK，MMPs/TIMPs,PDGF,VEGF，TGF
‑
β1，FGF)检测，得到M2a(CD206+CD209/DC
‑
SIGN+CD163+CD16
‑
Merreceptortyrosinekinase(MerTK)
‑
)细胞及M2c(CD206
‑
CD209/DC
‑
SIGN
‑
CD163+CD16+Merreceptor tyrosinekinase(MerTK)+)细胞；步骤五：按照步骤一培养M0、M2a、M2c，孵育3天后，将培养基弃去，再向M2a、M2c及M0中加入新鲜α
‑
MEM培养基，24小时后收集条件培养基，从而得到M2a
‑
CM、M2c
‑
CM及M0
‑
CM，M2a
‑
CM与M2c
‑
CM体积1:1混合作为M...

【专利技术属性】
技术研发人员：李慧，余日月，杨禾丰，马博，乔佳，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京世纪坛医院，
类型：发明
国别省市：