鲜黄芪来源的纳米颗粒极化肿瘤相关巨噬细胞制造技术

本发明专利技术公开了鲜黄芪来源的纳米颗粒极化肿瘤相关巨噬细胞，包括鲜黄芪来源纳米颗粒(ADNPs)的提取，其中将ADNPs提取后进行初步性质鉴定，将ADNPs对M2

【技术实现步骤摘要】
具有抗癌作用。黄芪来源纳米囊泡能够有效保护罗非鱼免受气单胞菌的感染[42]。但是鲜黄芪来源的纳米囊泡(Astragalus derived nanoparticles，ADNPs)是否能够基于归经理论对特定脏腑组织进行靶向作用，并被巨噬细胞等固有免疫细胞摄取，进一步调节抗肿瘤免疫应答的研究及其作用机制不明，有待进一步挖掘。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是，克服以上技术缺陷，提供一种对黄芪来源纳米颗粒极化肿瘤相关巨噬细胞的研究方法。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案为：鲜黄芪来源的纳米颗粒极化肿瘤相关巨噬细胞，包括鲜黄芪来源纳米颗粒(ADNPs)的提取，其中将ADNPs提取后进行初步性质鉴定，将ADNPs对M2
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BMDM处理分析，对ADNPs的生物学分布进行检测。
[0008]作为改进，所述鲜黄芪来源纳米颗粒(ADNPs)提取包括以下步骤：
[0009]步骤1：用清水清洗新鲜黄芪的根，并用干净的吸水纸吸取表面多余的水分；
[0010]步骤2：将鲜黄芪根切成2
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5cm的小段，去除坏死部分；
[0011]步骤3：用韩国惠仁低速榨汁机(型号H300)进行低速榨汁；
[0012]步骤4：将所得鲜黄芪汁进行2000rpm，20min离心，并分离其上清液，并重复此步骤；
[0013]步骤5：将上清液进行100000rpm，20min离心。并分离器上清液；
[0014]步骤6：将上清液进行100000rpm，1h超速离心，并获取其沉淀；
[0015]步骤7：将无菌无外泌体的PBS加入沉淀，并进行反复吹打，并用均质仪处理20min，最后用0.45μm的膜过滤除菌，获得ADNPs可以保存在
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80℃环境。
[0016]作为改进，所述ADNPs对M2型巨噬细胞处理具体为运用流式细胞分析术，观察 ADNPs对于类M2型BMDMs的活化情况，分析其CD206、CD86、CD80等蛋白分子的表达情况，同时检测细胞上清中的TNFα，IL
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6蛋白含量。
[0017]作为改进，所述ADNPs的生物学分布检测包括将ADNPs静脉注入小鼠后通过活体成像仪观察尾静脉给药后DiO
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ADNPs在4T1原位移植瘤小鼠体内的分布情况，所述ADNPs 注射量为10mg/kg DiO
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ADNPs通过尾静脉注射两次(隔日一次)。
[0018]作为改进，将重制备的M2
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BMDMs使用ADNPs处理24h，对样本进行了转录组学检测分析其数据。
[0019]作为改进，所述ADNPs进行尾静脉给药后，对小鼠原位移植瘤的生长情况进行分析记录。
[0020]本专利技术与现有技术相比的优点在于：本申请通过将ADNPs提取后对其进行性质检测，同时将其对M2
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BMDM进行处理分析，分析得到其实用价值，证明了其可以极化小鼠巨噬细胞，同时可以抑制小鼠三阴性乳腺癌的生长，为ADNPs的临床应用提供了基础。
附图说明
[0021]图1是ADNPs的透射电镜图。
[0022]图2是ADNPs粒径检测结果。
[0023]图3是高分辨液质联用对ADNPs化学成分的鉴定(mzCloud best match>85)。
science,2019,110(7):2080
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9.)。
[0040]CD206，又名巨噬细胞甘露糖受体，缺失于淋巴细胞及单核细胞表面，但在单核细胞分化为巨噬细胞后开始表达。且CD206是M2型巨噬细胞的标志物，具有高度的特异性 (XIE M,HUANG X,YE X,et al.Prognostic and clinicopathological significance of PD
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1/PD
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L1 expression in the tumor microenvironment and neoplastic cells for lymphoma[J].International immunopharmacology,2019,77(105999.)。
[0041]运用流式细胞分析术，观察ADNPs对于类M2型BMDMs的活化情况，通过分析 CD206、CD86、CD80等一些蛋白分子的表达情况可知ADNPs的处理能够增加巨噬细胞表面CD86和CD80的表达水平，降低CD206蛋白表达水平，同时检测细胞上清中的TNFα，IL
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6蛋白含量，实验结果表明ADNPs+M2组较M2组能分泌更多的TNFα，IL
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6炎症因子(图4B)。而这两种炎症因子已经被证实能有效活化下游适应性免疫应答，并进一步杀伤肿瘤。这些结果表明，ADNPs可以有效极化类M2型巨噬细胞为类M1型巨噬细胞。请着重参考图6，ADNPs对BMDMs抗肿瘤免疫功能的影响，(A)运用流式细胞分析术，分析BMDMs表面CD80、CD86、CD206功能蛋白表达情况。(n＝3，One
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WayANOVA)，(B)运用ELISA分析ADNPs处理BMDMs细胞上清中，TNFα，IL
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6炎症因子浓度变化。(n＝3，One
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Way ANOVA)。
[0042]ADNPs小鼠体内生物学分布的探索，通过运用小动物活体成像仪观察尾静脉给药后 DiO
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ADNPs在4T1原位移植瘤小鼠体内的分布情况，通过观察发现ADNPs能够在肺脏、脾脏、肝脏、肿瘤有很好的富集，因为肝脏及肿瘤组织中均有大量的巨噬细胞及DC细胞更易吞噬纳米颗粒，因此促进了ADNPs对这些组织的浸润。
[0043]ADNPs重编程M2
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BMDMs的机制,为明确ADNPs极化TAMs的机制通路,通过提取并制备M2
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BMDMs，并用ADNPs处理24h。对样本进行了转录组学检测，通过数据分析可以发现，有大量的基因转录水平发生巨大变化，通过KEGG信号通路富集分析，可以发现Toll样受体通路相关基因组间变化更为显著，对比M2
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BMDM细胞中Toll相关基因转录水平发现，表达差异排名前25的基因多集中于促进巨噬细胞类M1活化通路，通过进一步分析可以发现，ADNPs处理后类M2型巨噬细胞内的TLR2
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Myd88
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TBK1
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NFκB相关转录水平有显著提升。
[0044]如图8中Control组及ADNPs处理组(A)KEGG信号通路富集图。(B)Toll样受体信号通路蛋白变化情况。(C)Toll样受体信号通路蛋白变化Top25基因转录组表达差异分析热图。(D)火山图呈现TLR2
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Myd88
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TBK1
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NFκB转录本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.鲜黄芪来源的纳米颗粒极化肿瘤相关巨噬细胞，其特征在于：包括鲜黄芪来源纳米颗粒(ADNPs)的提取，其中将ADNPs提取后进行初步性质鉴定，将ADNPs对M2
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BMDM处理分析，对ADNPs的生物学分布进行检测。2.根据权利要求1所述的鲜黄芪来源的纳米颗粒极化肿瘤相关巨噬细胞，其特征在于：所述鲜黄芪来源纳米颗粒(ADNPs)提取包括以下步骤：步骤1：用清水清洗新鲜黄芪的根，并用干净的吸水纸吸取表面多余的水分；步骤2：将鲜黄芪根切成2
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5cm的小段，去除坏死部分；步骤3：用韩国惠仁低速榨汁机(型号H300)进行低速榨汁；步骤4：将所得鲜黄芪汁进行2000rpm，20min离心，并分离其上清液，并重复此步骤；步骤5：将上清液进行100000rpm，20min离心。并分离器上清液；步骤6：将上清液进行100000rpm，1h超速离心，并获取其沉淀；步骤7：将无菌无外泌体的PBS加入沉淀，并进行反复吹打，并用均质仪处理20min，最后用0.45μm的膜过滤除菌，获得ADNPs可以保存在
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80℃环境。3.根据权利要求1所述的鲜黄...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩暄，曹鹏，詹其琛，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：