一种将免疫引入骨修复的体外仿生组织评价模型及其应用制造技术

本发明专利技术属于医学技术领域，公开了一种将免疫引入骨修复的体外仿生组织评价模型及其应用，具体公开了一种多层混合细胞片叠层化物，所述包括多层混合细胞片叠层化物由n片细胞薄膜构成，n≥3，所述细胞包括述干细胞和巨噬细胞。本发明专利技术将巨噬细胞引入干细胞的多层混合细胞片叠层化物，所得到的多层混合细胞片叠层化物可以更加的还原体内三维骨组织，更接近于体内骨组织的微环境，保证了紧密的成骨细胞之间相互连接以及成骨细胞与骨修复材料的相互作用，便于加入骨修复材料，从而可以有效评价骨修复材料的功能和特性，有利于更真实预测体内骨修复材料的有效性。骨修复材料的有效性。

【技术实现步骤摘要】
一种将免疫引入骨修复的体外仿生组织评价模型及其应用


[0001]本专利技术属医学
，具体涉及一种将免疫引入骨修复的体外仿生组织评价模型 及其应用。

技术介绍

[0002]巨噬细胞表现出两种极化表型(M1和M2)，在免疫调节过程中起着至关重要的作 用。通过上调干扰素
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γ(IFN
‑
γ)的释放，可以观察到M1表型的分化，然后是由白细胞 介素
‑
4(IL
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4)刺激的M2表型的极化。从机制上讲，促进M2巨噬细胞极化和白细胞 介素
‑
4分泌，从而促进hBMSC成骨分化，进一步促进内源性骨再生。在各种先天免疫 细胞中，巨噬细胞是生物材料相关免疫反应中最重要的效应物之一。适应多变的微环境， 巨噬细胞战术性地转变为经典激活的M1表型或M2表型，以分别介导炎症和维持组织 稳态。M1巨噬细胞通过产生细胞因子如诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和肿瘤坏死因子 来加剧炎症，而M2巨噬细胞通过产生抗炎因子如精氨酸酶
‑
1和白细胞介素促进组织愈 合。据报道，向不同的巨噬细胞极化转变可能会影响组织再生的结果。切换到M2巨噬 细胞极化被认为是一种有利的适应。此外，巨噬细胞通过分泌骨诱导因子，如转化生长 因子β和骨形态发生蛋白2(BMP2)，对成骨细胞的有效矿化和体内骨形成至关重要。
[0003]细胞薄膜技术已在组织工程应用数年，以再生受损的软组织，包括角膜上皮、牙周 膜、膀胱上皮、肾小球、食管上皮、心肌细胞和肝细胞。细胞薄膜包括沉积的细胞外基 质(ECM)的完整单层中非侵入性地收获高活力细胞。ECM提供了必要的结构和粘合 特性，用于在移植过程中保持细胞片的完整性和抵抗变形力。细胞薄膜叠层技术是更加 完善的构建三维仿生组织的技术，相比于二维细胞薄膜技术，三维仿生组织可以高度还 原组织器官的内环境和细胞外基质环境，可以为骨诱导材料提供合适的骨修复环境，在 骨骼修复过程中具有优异的成骨特性和增强骨缺损愈合。

技术实现思路

[0004]本专利技术第一方面的目的，在于提供一种多层混合细胞片叠层化物。
[0005]本专利技术第二方面的目的，在于提供一种多层仿生骨组织的体外培养体系。
[0006]本专利技术第三方面的目的，在于提供一种多层仿生骨组织。
[0007]本专利技术第四方面的目的，在于提供本专利技术第三方面的多层仿生骨组织的制备方法。
[0008]本专利技术第五方面的目的，在于提供本专利技术第一方面的多层混合细胞片叠层化物、第 二方面的体外培养体系和/或第三方面的多层仿生骨组织在修复组织器官中的应用。
[0009]本专利技术第六方面的目的，在于提供本专利技术第一方面的多层混合细胞片叠层化物、第 二方面的体外培养体系和/或第三方面的多层仿生骨组织在组织再生中的应用。
[0010]本专利技术第七方面的目的，在于提供一种骨修复材料体外评价模型。
[0011]本专利技术第八方面的目的，在于提供一种骨修复材料的评价方法。
[0012]为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
[0013]本专利技术的第一个方面，提供一种多层混合细胞片叠层化物，所述包括多层混合细胞 片叠层化物由n片细胞薄膜构成，n≥3，所述细胞包括述干细胞和巨噬细胞。
[0014]优选地，所述细胞薄膜的制备方法包括以下步骤：将干细胞和巨噬细胞混合培养， 接种至培养容器内，培养，剥离，即得到细胞薄膜。
[0015]优选地，所述巨噬细胞与干细胞混合前使用含有弗波醇肉豆蔻酸脂醋酸酯的培养基 培养。
[0016]进一步优选地，所述弗波醇肉豆蔻酸脂醋酸酯的终浓度为180～250ng/mL；更进一 步为200ng/mL。
[0017]优选地，所述干细胞和巨噬细胞混合培养的培养基中含有白介素
‑
4；进一步优选地， 所述白介素
‑
4的终浓度为15～25ng/mL，更进一步为20ng/mL。
[0018]优选地，所述培养的培养基中含有地塞米松、抗坏血酸、Ficoll400、ITS细胞培养 添加物、FBS和青链霉素。
[0019]进一步优选地，所述培养的培养基中含有0.1～0.2μM地塞米松、0.05～0.1g/L抗坏 血酸、20～30g/L Ficoll400、1w/v％～3w/v％ITS、10v/v％～20v/v％胎牛血清和1w/v％～3w/v％ 青链霉素。
[0020]优选地，所述干细胞和巨噬细胞的细胞数量比为1:(1～2)；进一步为1:1。
[0021]优选地，所述细胞的接种数为30～50万；优选为30～40万；更优选为40万。
[0022]优选地，所述培养的条件为30～39℃、5～7％CO2浓度培养3～7天；进一步为35～37℃、 5～7％CO2浓度培养3～5天；最优为37℃、5％CO2浓度下培养4天。
[0023]优选地，当所述培养容器为普通培养皿时，则在接种细胞前在培养皿内部贴上环状 材料；所述环形材料由高分子水凝胶或硅胶中制备得到；环状材料可以与培养容器迅速 粘贴，紧密组装在一起时无漏液现象出现，且可以任意拆分。
[0024]优选地，所述的剥离的方法为用移液枪轻轻吹打培养皿边缘。
[0025]优选地，所述多层混合细胞片叠层化物的制备方法包括以下步骤：
[0026](1)将细胞薄膜置于培养容器内，培养；
[0027](2)取骨细胞薄膜叠于步骤(1)的细胞薄膜上，培养；
[0028](3)重复步骤(2)直至得到具有n层的细胞薄膜，n≥3，即得到多层混合细胞片 叠层化物。
[0029]进一步优选地，步骤(1)和步骤(2)所述培养的条件为30～39℃、3％～7％CO2浓 度培养25～35min。
[0030]优选地，所述干细胞包括原代细胞多能干细胞；进一步包括间充质干细胞，更进一 步为骨髓间充质干细胞。
[0031]优选地，所述骨髓间充质干细胞来源为人源。
[0032]优选地，所述巨噬细胞包括单核细胞；进一步包括THP
‑
1。
[0033]本专利技术的第二个方面，提供一种多层仿生骨组织的体外培养体系，所述体外培养体 系包括本专利技术第一方面的多层混合细胞片叠层化物。
[0034]优选地，所述体外培养体系还包括成骨诱导培养液。
[0035]本专利技术的第三个方面，提供一种多层仿生骨组织，由本专利技术第一方面的多层混合
细 胞片叠层化物经过成骨诱导培养得到。
[0036]本专利技术的第四个方面，提供本专利技术第三方面的多层仿生骨组织的制备方法，多层混 合细胞片叠层化物与成骨诱导培养液混合，培养，即得到多层仿生骨组织。
[0037]优选地，所述培养的条件为30～37℃、3％～7％CO2浓度培养7～21天；进一步为 35～37℃、5％～7％CO2浓度培养7～21天；更进一步为35℃、5％CO2浓度培养14～21天。
[0038]本专利技术的第五个方面，提供本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多层混合细胞片叠层化物，其特征在于，所述包括多层混合细胞片叠层化物由n片细胞薄膜构成，n≥3，所述细胞包括述干细胞和巨噬细胞。2.根据权利要求1所述的多层混合细胞片叠层化物，其特征在于，所述细胞薄膜的制备方法包括以下步骤：将干细胞和巨噬细胞混合培养，接种至培养容器内，培养，剥离，即得到细胞薄膜；优选地，所述巨噬细胞与干细胞混合前使用含有弗波醇肉豆蔻酸脂醋酸酯的培养基培养。3.根据权利要求2所述的多层混合细胞片叠层化物，其特征在于，所述干细胞和巨噬细胞混合培养的培养基中含有白介素
‑
4；优选地，所述白介素
‑
4的终浓度为15～25ng/mL。4.一种多层仿生骨组织的体外培养体系，其特征在于，所述体外培养体系包括权利要求1～3中任一项所述的多层混合细胞片叠层化物；优选地，所述体外培养体系还包括成骨诱导培养液。5.一种多层仿生骨组织，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：郜晶，高博韬，
申请(专利权)人：广东省科学院生物与医学工程研究所，
类型：发明
国别省市：