本发明专利技术涉及免疫学、细胞生物学和再生医学交叉技术领域，具体而言，涉及修复型巨噬细胞、培养液及其应用。修复型巨噬细胞利用TAMs的培养液或肿瘤提取液培养单核细胞或巨噬细胞得到。该修复型巨噬细胞具备很好的促进创伤愈合的功能。的功能。的功能。
【技术实现步骤摘要】
修复型巨噬细胞、培养液及其应用
[0001]本专利技术涉及免疫学、细胞生物学和再生医学交叉
，具体而言，涉及修复型巨噬细胞、培养液及其应用。
技术介绍
[0002]糖尿病最为普遍和严重的并发症之一是俗称“糖尿病足”的慢性皮肤创伤，其多发于下肢，形成溃疡，难愈合甚至不愈合，已成为下肢截肢的首要原因，严重影响全球人类健康。然而，目前对于糖尿病创伤，无针对性治疗策略或药物，以常规护理和清创为主，治疗效果不佳，复发率高。
[0003]近年来对于糖尿病创伤的病理学研究不断深入，揭示其不同于普通皮肤创伤的生物学机制。普通皮肤创伤愈合可大致分为凝血、炎症、增殖和重塑四个阶段。其中，作为固有免疫系统核心成员的巨噬细胞(及其前体
‑
单核细胞)发挥着关键作用。例如，在修复早期，单核细胞表达炎性因子并分化为炎性巨噬细胞，发挥吞噬病原体、招募细胞、促进血管新生等作用；而在修复后期，这类单核细胞转而表达抑炎性和促进再生的细胞因子，促进成纤维细胞增殖、血管成熟、基质重塑等，以高度动态和协同的方式完成创面愈合和组织修复。然而，糖尿病创面难以愈合的一个关键因素，即是在糖尿病病理情况下，创面局部的单核细胞或巨噬细胞从促炎性朝抑炎性的表型转变受阻，不仅无法发挥其在修复后期应该发挥的生理功能，而且还释放信号招募更多的炎性单核细胞进入创面，放大这一病理效应，造成局部持续炎症、并破坏创面的血管网络，阻碍修复。正因为这一复杂和综合的病理因素，单一靶点(如仅仅抑炎或促进细胞生长)的药物或治疗手段，即使在普通创伤愈合中有一定的作用，也难以有效促进糖尿病创伤愈合。因此，亟需提供一种新的巨噬细胞，具备很好的促进创伤愈合的功能。
[0004]鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的在于提供修复型巨噬细胞、培养液及其应用。本专利技术实施例提供一种新的修复型巨噬细胞，该修复型巨噬细胞具备很好的促进创伤愈合的功能。
[0006]本专利技术是这样实现的：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种修复型巨噬细胞，其利用TAMs的培养液或肿瘤提取液培养单核细胞或巨噬细胞得到。
[0008]在可选的实施方式中，所述TAMs的培养液是将TAMs在完全培养基内培养15
‑
20天后得到的培养液；
[0009]优选地，所述完全培养基包括1640完全培养基。
[0010]在可选的实施方式中，所述TAMs是从肿瘤中分离得到的细胞。在可选的实施方式中，形成TAMs的步骤包括：将剪碎的肿瘤与胶原蛋白水解酶、核酸内切酶混合进行消化，而后过滤得到单细胞悬液，接着，利用红细胞裂解液去除红细胞，将所述单细胞悬液与白细胞
共同抗原磁珠进行孵育，而后分选白细胞共同抗原阳性细胞，接着，将白细胞共同抗原阳性细胞与CD45,CD11b,Ly6G,,Ly6C,MHC II和SiglecF抗体进行孵育，而后分选TAMs；
[0011]优选地，形成TAMs的步骤包括：将剪碎的肿瘤转入含有胶原酶型Ⅳ和DNaseⅠ的裂解缓冲液中进行消化，形成单细胞和未消化的肿瘤组织块的混合物，而后将所述混合物进行过滤去除未消化的肿瘤组织块，得到总单细胞悬液，接着，利用红细胞裂解液对过滤后的总单细胞悬液进行处理，去除红细胞，再用磷酸缓冲液进行重悬形成单细胞悬液，将所述单细胞悬液与CD45磁珠孵育，而后分选CD45阳性的细胞，随后，CD45阳性细胞与CD45,CD11b,Ly6G,,Ly6C,MHC II和SiglecF抗体在冰上避光孵育，通过流式分选技术将TAMs分选出来。
[0012]在可选的实施方式中，形成所述肿瘤提取液的步骤包括：将剪碎的肿瘤与缓冲液混合进行匀浆，而后离心得到上清液；
[0013]优选地，形成所述肿瘤提取液的步骤包括：将剪碎的肿瘤与磷酸缓冲液按照0.2～0.5g肿瘤/1毫升的比例混合，而后进行多次匀浆，再离心，收集上清液。
[0014]在可选的实施方式中，所述肿瘤包括骨肉瘤、黑色素瘤、小鼠结肠腺癌和小鼠乳腺癌中的任意一种。
[0015]在可选的实施方式中，所述单核细胞和所述巨噬细胞均为从正常组织得到的细胞；
[0016]优选地，所述单核细胞和所述巨噬细胞均来源哺乳动物，
[0017]优选地，所述单核细胞来源于骨髓单核细胞或外周血单核细胞；
[0018]所述巨噬细胞来源于骨髓巨噬细胞或腹腔巨噬细胞。
[0019]在可选的实施方式中，每毫升TAMs的培养液对应添加0.25
×
107～1
×
107个单核细胞或0.25
×
107～1
×
107个巨噬细胞；每毫升肿瘤提取液对应添加0.25
×
107～1
×
107个单核细胞或0.25
×
107～1
×
107个巨噬细胞；
[0020]优选地，培养所述单核细胞或所述巨噬细胞的步骤包括：将所述单核细胞或所述巨噬细胞接种至含有TAMs的培养液的第一接种培养基或含有肿瘤提取液的第二接种培养基中，在37～38℃的条件下培养36
‑
50小时；
[0021]优选地，TAMs的培养液在所述第一接种培养基中的体积浓度为15
‑
25％；
[0022]优选地，所述肿瘤提取液在所述第二接种培养基中的浓度为20
‑
40μg/ml。
[0023]第二方面，本专利技术提供一种培养液，其通过培养前述实施方式任一项所述的修复型巨噬细胞得到。
[0024]第三方面，本专利技术提供一种前述实施方式所述的修复型巨噬细胞或前述实施方式所述的培养液在制备以下任意一种制剂中的应用；
[0025](1)诱导未极化的巨噬细胞向抑炎表型转变的诱导制剂；
[0026](2)促进血管新生的修复剂；
[0027](3)诱导成纤维细胞活化的活化剂；
[0028](4)促进胶原沉积的制剂。
[0029]第四方面，本专利技术提供一种前述实施方式所述的修复型巨噬细胞在制备促进皮肤创面愈合的药物中的应用；
[0030]优选地，所述药物为促进糖尿病创面愈合的药物。
[0031]本专利技术具有以下有益效果：本专利技术实施例通过利用TAMs的培养液或肿瘤提取液培
养单核细胞或巨噬细胞，继而诱导单核细胞或巨噬细胞转化为修复型巨噬细胞，该修复型巨噬细胞经诱导后高表达CD80，CD163,CD206等表面生物标志物，高分泌IL
‑
4，IL
‑
16等促进免疫抑制的细胞因子，继而可以有效抑制炎症。同时，其还高分泌Amphiregulin，IGFBP
‑
3，Pentraxin3等促进血管新生的细胞因子，高分泌PDGF
‑
B，aFGF等促进细胞增殖和基质分泌的细胞因子，继而促进血管新生。同时，其还可促进成纤维活化和成纤维胶原沉积，进一步促进受损血管修复。通过上述本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种修复型巨噬细胞，其特征在于，其利用TAMs的培养液或肿瘤提取液培养单核细胞或巨噬细胞得到。2.根据权利要求1所述的修复型巨噬细胞，其特征在于，所述TAMs的培养液是将TAMs在完全培养基内培养15
‑
20天后得到的培养液；优选地，所述完全培养基包括1640完全培养基；优选地，所述TAMs是从肿瘤中分离得到的细胞。3.根据权利要求2所述的修复型巨噬细胞，其特征在于，形成TAMs的步骤包括：将剪碎的肿瘤与胶原蛋白水解酶、核酸内切酶混合进行消化，而后过滤得到单细胞悬液，接着，利用红细胞裂解液去除红细胞，将所述单细胞悬液与白细胞共同抗原磁珠进行孵育，而后分选白细胞共同抗原阳性细胞，接着，将白细胞共同抗原阳性细胞与CD45,CD11b,Ly6G,,Ly6C,MHC II和SiglecF抗体进行孵育，而后分选TAMs；优选地，形成TAMs的步骤包括：将剪碎的肿瘤转入含有胶原酶型Ⅳ和DNaseⅠ的裂解缓冲液中进行消化，形成单细胞和未消化的肿瘤组织块的混合物，而后将所述混合物进行过滤去除未消化的肿瘤组织块，得到总单细胞悬液，接着，利用红细胞裂解液对过滤后的总单细胞悬液进行处理，去除红细胞，再用磷酸缓冲液进行重悬形成单细胞悬液，将所述单细胞悬液与CD45磁珠孵育，而后分选CD45阳性的细胞，随后，CD45阳性细胞与CD45,CD11b,Ly6G,,Ly6C,MHC II和SiglecF抗体在冰上避光孵育，通过流式分选技术将TAMs分选出来。4.根据权利要求1所述的修复型巨噬细胞，其特征在于，形成所述肿瘤提取液的步骤包括：将剪碎的肿瘤与缓冲液混合进行匀浆，而后离心得到上清液；优选地，形成所述肿瘤提取液的步骤包括：将剪碎的肿瘤与磷酸缓冲液按照0.2～0.5g肿瘤/1毫升的比例混合，而后进行多次匀浆，再离心，收集上清液。5.根据权利要求2
‑
4任一项所述的修复型巨噬细胞，其特征在于，所述肿瘤包括骨肉瘤、黑色素瘤、小鼠结肠腺癌和小...
【专利技术属性】
技术研发人员：王春明，母若雨，张哲，
申请(专利权)人：澳门大学，
类型：发明
国别省市：
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