促进CD34制造技术

本发明专利技术涉及一种促进CD34

【技术实现步骤摘要】
促进CD34
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细胞向CD16
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巨噬细胞分化并向M2极化的方法


[0001]本专利技术涉及细胞治疗
，尤其涉及一种人脑类器官来源间充质干细胞促进脐带血来源的CD34
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细胞向巨噬细胞诱导分化以及促进巨噬细胞向M2极化的方法。
技术背景
[0002]急性移植物抗宿主病(aGVHD)仍然是异基因造血干细胞移植的重要合并症。aGVHD通常被认为是一种免疫介导的疾病，具体地说，异体供者移植物中的T淋巴细胞，经受者发动的一系列“细胞因子风暴”刺激，大大增强了其对受者抗原的免疫反应，以受者靶细胞为目标发动细胞毒攻击，其中皮肤、肝及肠道是主要的靶目标，导致患者相关死亡率增高及医疗费用增高。糖皮质激素是目前aGVHD的一线治疗方案，但是仍有40
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60％患者出现激素耐药，且现有二线治疗效果欠佳。因此，aGVHD发病机制的深入阐明及其新型治疗策略的建立是亟待解决的重要临床科学问题。
[0003]巨噬细胞是机体重要免疫细胞之一，由骨髓单核细胞分化成熟而来，具有极强的异质性。不仅是病原微生物、坏死组织的主要清理细胞，还具有抗原递呈和分泌多种细胞因子的功能，在特异性免疫反应的诱发和免疫调节过程中起关健作用。在欧洲多中心合作的临床研究中，已经开始在肾移植后使用供体来源的巨噬细胞，经过一年多的追踪随访，认为其在肾移植上的使用是安全及有效的(James A.Hutchinson,PalomaRiquelme,andEdwardK.Geissler.Human regulatory macrophages as a cell
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based medicinalproduct.CurrOpin Organ Transplant2012；17:48
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54)。因此在临床应用中，使用巨噬细胞将成为一种很有潜力的预防移植后免疫排斥的干预措施。
[0004]CD16是连接细胞免疫和体液免疫的桥梁，在巨噬细胞的ADCC(抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用，antibody
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dependent cell
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mediated cytotoxicity)作用中具有重要地位。在肝脏巨噬细胞中增强CD16表达可提高肝脏巨噬细胞通过ADCC对肝细胞肝癌的溶解作用(膜受体CD16在Kupffer细胞杀伤肝细胞肝癌中的作用及机制探讨，丁雄，2006)。外周血CD16
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CD14
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单核巨噬细胞比CD16
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CD14
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性的单核巨噬细胞具有更强的免疫抑制作用和吞噬活性(P.Vishnyakova，2021，The response of two polar monocyte subsets to inflammation；SuJeong Lee，2021，Activated Platelets Convert CD14
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CD16
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Into CD14
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CD16
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Monocytes With Enhanced FcgR
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Mediated Phagocytosis and Skewed M2 Polarization)。
[0005]巨噬细胞其功能发挥与周围微环境相关，微环境中的细胞因子、微生物等可以导致巨噬细胞极化成不同表型和功能的细胞亚群，主要包括经典激活型巨噬细胞(M1)和选择激活型巨噬细胞(M2)，两类巨噬细胞表型及功能迥异。M1/M2极化失衡参与了多种自身免疫学疾病、代谢性及炎症性疾病的发生。功能上，M1可高表达促炎因子，具有强大的抗微生物和抗肿瘤活性，并介导活性氧诱导的组织损伤，抑制组织再生及愈合；M2表达抗炎因子，具有强大的吞噬能力，可清除碎片及凋亡细胞，促进组织修复及愈合，并具有促血管生成和促纤维化的特性。在不同条件下，这两种极端可以相互转化。Nahrendor等发现在急性心肌梗
死过程中巨噬细胞的M1/M2表型会转化。
[0006]目前巨噬细胞的培养主要采用直接培养法或诱导培养法。直接培养法即直接分离巨噬细胞进行培养，此方法操作比较繁琐，巨噬细胞回收率不高，且分离到的细胞大多是成熟的巨噬细胞，在体外不再分裂增殖。诱导培养法则利用外源性细胞因子将干细胞、单核细胞等前体细胞诱导成巨噬细胞的培养方法，甚至一些研究小组已经成功地利用多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs；human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)制造巨噬细胞。诱导多能干细胞易于操作产生基因编辑的巨噬细胞，或直接分化为正常的巨噬细胞。但目前这些分化流程存在操作繁杂、耗时较长、采用动物源性成分的试剂、成本较高、并且产量受到限制等，所以分化巨噬细胞的方法需要进一步去探索。
[0007]脐血内含有丰富的造血干/祖细胞，目前在临床上广泛应用于白血病、再生障碍性贫血、遗传性疾病和肿瘤等多种疾病的治疗,取得理想效果并显示出良好前景。目前已有超过4万多例UCB移植被批准，在世界范围内，来自公共和私人细胞库的UCB正被尝试用于治疗神经、代谢、免疫和肿瘤等相关疾病。这取决于从脐血中获得的细胞来源广泛、无创伤性、并且免疫原性低等特点。因此，从脐血中分离造血干/祖细胞并诱导得到巨噬细胞，并确定纯度和功能，将大大有助于其在临床上的使用。但现有技术得到的巨噬细胞在纯度和数量，以及CD16表达强度等方面均需要提高。

技术实现思路

[0008]为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的之一在于提供一种促进CD34
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细胞向巨噬细胞分化的方法，该方法将人脑类器官来源的间充质干细胞N
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MSC和脐带血来源的CD34
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细胞在培养基中共培养14～21d，得到由所述CD34
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细胞分化的巨噬细胞；所述CD34
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细胞为造血干细胞或造血祖细胞。
[0009]优选的，根据所需的巨噬细胞特征，选择相应的培养基，具体为：
[0010]采用无任何细胞因子的基础培养基培养14～21d，获得CD34
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细胞分化率在15～30％的临床级巨噬细胞；
[0011]或采用巨噬细胞诱导分化培养基培养14～28d，获得CD34
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细胞分化率在80～99％的巨噬细胞；
[0012]所述巨噬细胞均表达CD45CD11bCD14标记，所述基础培养基为α
‑
MEM培养基，所述诱导分化培养基为IMDM培养基。
[0013]优选的，所述α
‑
MEM培养基中还添加有分别占α
‑
MEM体积1％的NEAA、1％的L
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Glu、1％的Anti
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anti和20％的人AB血清；所述诱导分化培养基包括第一阶段培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进CD34
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细胞向巨噬细胞分化的方法，其特征在于，将人脑类器官来源的间充质干细胞N
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MSC和脐带血来源的CD34
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细胞在培养基中共培养14～28d，得到由所述CD34
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细胞分化的巨噬细胞；所述CD34
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细胞为造血干细胞或造血祖细胞。2.如权利要求1所述的一种促进CD34
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细胞向巨噬细胞分化的方法，其特征在于，根据所需的巨噬细胞特征，选择相应的培养基，具体为：采用无任何细胞因子的基础培养基培养14～21d，获得CD34
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细胞分化率在15～30％的巨噬细胞；或采用巨噬细胞诱导分化培养基培养14～28d，获得CD34
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细胞分化率在80～99％的巨噬细胞；所述巨噬细胞均表达CD45CD11bCD14标记，所述基础培养基为α
‑
MEM培养基，所述诱导分化培养基为IMDM培养基。3.如权利要求2所述的一种促进CD34
+
细胞向巨噬细胞分化的方法，其特征在于，所述α
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MEM培养基中还分别添加有占α
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MEM体积1％的NEAA、1％的L
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Glu、1％的Anti
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anti和20％的人AB血清；所述诱导分化培养基包括第一阶段培养基和第二阶段培养基，所述第一阶段培养基为IMDM中加入占IMDM体积10％的人AB血清，以及20ng/ml SCF、5ng/mlTPO、5ng/ml FLT
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3、50ng/ml M
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CSF，所述第二阶段培养基为IMDM中加入占IMDM体积10％的人AB血清以及50ng/ml M
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CSF。4.如权利要求3所述的一种促进CD34
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细胞向巨噬细胞分化的方法，其特征在于，所述第一阶段培养基用于D0
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D7培养，所述第...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪桂琴，周莉，朱华建，叶岚岚，
申请(专利权)人：晟造源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：