一种DNA修饰胶体化巨噬细胞的制备、使用方法及其应用技术

本发明专利技术涉及细菌检测技术领域，公开了一种DNA修饰胶体化巨噬细胞的制备方法，具体如下：将巨噬细胞经平板培养密度后达70％～85％后，加入磁性氧化铁纳米颗粒溶液继续孵育一段时间，待细胞吞噬磁性颗粒后，消化获得悬浮磁化细胞；将光引发剂2

【技术实现步骤摘要】
一种DNA修饰胶体化巨噬细胞的制备、使用方法及其应用


[0001]本专利技术属于细菌检测
，具体涉及一种DNA修饰胶体化巨噬细胞的制备、使用方法及其应用。

技术介绍

[0002]细菌感染严重影响人类健康，快速、准确和高灵敏性的细菌分离与检测方法能够为细菌性传染病的早期诊断提供有力支持。目前，细菌分析主要依赖传统的分离培养试验、普通PCR法和酶联免疫实验等。分离培养法操作步骤多、耗时长且需要特定的操作培养条件，无法实现病原细菌的快速鉴定。普通PCR检测技术利用核酸引物进行核酸检测(如聚合酶链反应)具有良好的灵敏度，但核酸检测的流程较为复杂，涉及如细胞裂解、核酸提取、磁分离、洗涤和扩增等)，并且需要额外的变温设备。免疫学检测法如免疫胶体金试纸，由于其简单、成本低、信号生成速度快，十分适合病原体的快速鉴定分析。然而，免疫检测法通常需要花费大量精力去筛选和优化一对高特异性的生物受体(抗体)。同时，免疫试纸条的使用必须提前知晓样品中是否含有目标细菌，当样本中存在未知的病原体时，则难以部署实施。此外，细菌在感染人体过程中，会分泌多种外毒素攻击宿主。目前国内外可同时检测细菌菌体及相关外毒素的技术尚未见报道。
[0003]人体内的免疫细胞如巨噬细胞树突状细胞和中性粒细胞等经过千百万年的进化，具有极其优异的病原体微生物识别能力，能够广泛各种细菌、真菌及其分泌的毒力因子。根据目前国内外的研究结果，这些免疫细胞主要通过其细胞膜表面的蛋白质受体，如toll样受体(TLRs)、甘露糖受体、清道夫受体和补体受体等，介导微生物的识别与结合。值得注意的是，这种受体—配体结合的识别模式使得免疫细胞无法准确识别某一特定细菌，同时也不能由此产生可检测的信号。此外，活细胞无一旦脱离培养环境，会很快死亡破裂，而且脆弱的细胞体很容易受到外部环境及机械力变化的影响，这些因素严重限制了它们在体外细菌分析中的应用性。

技术实现思路

[0004]为解决
技术介绍
中所提出的技术问题，本专利技术提供一种凝胶化细胞颗粒的制备及在病原微生物检测方面的应用。
[0005]本专利技术采用以下技术方案实现：
[0006]一种DNA修饰胶体化巨噬细胞的制备方法，具体如下：
[0007]将巨噬细胞经平板培养密度后达70％～85％后，加入磁性氧化铁纳米颗粒溶液继续孵育一段时间，待细胞吞噬磁性颗粒后，消化获得悬浮磁化细胞；
[0008]将光引发剂2
‑
羟基
‑4’‑
(2
‑
羟基乙氧基)
‑2‑
甲基丙苯酮与聚乙二醇二丙烯酸酯混合，制备凝胶液；
[0009]然后，在细胞悬液中加入一定浓度的凝胶液，孵育后，低速离心收集细胞，并用磷酸缓冲液重悬细胞，使用波长为365nm的紫外灯照射细胞，引发聚合反应，获得胶体化的巨
噬细胞；
[0010]将DNA核酶链与胶体化巨噬细胞孵育，通过磁分离去除多余的DNA，并将得到的保存在4℃中以供后续使用，所述DNA核酶/底物链的终浓度为50～250nM，与胶体化巨噬细胞孵育时间为15～20分钟；所述反应缓冲液组分为1
×
PBS。
[0011]优选的，所使用的磁性氧化铁纳米颗粒浓度为40～70μg/mL，与巨噬细胞孵育8～24小时。
[0012]优选的，所述凝胶液中聚乙二醇二丙烯酸酯浓度为5～10wt％，分子量范围为500～1000Da。
[0013]优选的，所述光引发剂2
‑
羟基
‑4’‑
(2
‑
羟基乙氧基)
‑2‑
甲基丙苯酮终浓度为1.2～1.5g/mL，凝胶液与磁化的细胞孵育时间为5～10分钟。
[0014]优选的，采用365nm紫外灯照射细胞悬液时间为5～10分钟，紫外灯功率为10～50W。
[0015]本专利技术提出了将上述方案制得的所述DNA修饰胶体化巨噬细胞用于快速识别、捕获、富集和检测特定病原微生物。
[0016]本专利技术提出了所述的DNA修饰胶体化巨噬细胞在细菌分析中的使用方法，包括如下步骤：
[0017]将胶体化巨噬细胞溶液与含有菌的样本溶液在室温下振荡孵育一段时间，然后，用磁力架分离DNA修饰胶体化巨噬细胞，即并用PBS溶液洗涤；
[0018]然后，取3～5μL溶液进行显微镜观察，分析被捕捉的细菌形貌及个数。
[0019]在本专利技术中，由于细菌激活了胶体化巨噬细胞表面的DNA核酶，核酶自我切割后产生荧光信号，可以通过荧光显微镜或流式细胞仪分析胶体化巨噬细胞表面荧光信号来判断溶液中是否出现特定的细菌或定量分析某一种细菌。
[0020]优选的，所述悬液中细胞颗粒的个数为1
×
103～1
×
105个细胞。
[0021]优选的，所述溶液与样本溶液体积比为1：1，所述孵育时间为15～30分钟，所述混匀液振荡转速为200～450rpm；
[0022]优选的，所述反应缓冲液为10mM Tris
‑
HCl，150mM NaCl，10mM MgCl2，2mM CaCl2，pH 7.4。
[0023]本专利技术中涉及的胶体化巨噬细胞的制备和使用原理在于：巨噬细胞是哺乳动物体内天然的免疫细胞，具有极为强大的病原微生物识别能力。首先，利用巨噬细胞的吞噬特性，在培养基中引入磁性纳米颗粒，巨噬细胞能够大量吞噬这些颗粒，从而获得了能够对外部磁体产生响应的磁化细胞。其次，胶的单体和引发剂自由穿过细胞膜渗透到细胞内部。经过紫外灯照射后，单体发生聚合反应彼此交联，在细胞内部形成牢固的三维网络结构，极大地增强了细胞的机械强度，从而获得胶体化的巨噬细胞。最后，通过在胶体化巨噬细胞表面修饰DNA核酶，使得细胞颗粒能够对特定细菌产生响应性荧光信号。这是由于在特定的细菌存在下，其表面抗原或分泌物能够激活DNA核酶，使得DNA核酶分子能够切割自身并产生信号。在没有待测菌的情况下，DNA核酶上的荧光基团与淬灭基团彼此靠近，荧光淬灭。然而，当特定的菌存在时，DNA核酶被激活并切割自身核酸链，导致淬灭基团从细胞颗粒表面脱落，荧光基团的荧光恢复，从而达到报告特定细菌存在的目的。
[0024]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0025]1、胶体化的巨噬细胞由于含有胶体状的核心，其稳定性得以大幅提升，使得它们能够抵抗各种外部不利条件。与此同时，胶体化的巨噬细胞还保留了完整的细胞膜结构；
[0026]2、经过磁化处理的巨噬细胞可以很容易地通过外部磁铁进行操控，便于体外磁分选收集样本中的细菌和各种常规操作；
[0027]3、胶体化的巨噬细胞不仅可以通过细胞膜表面受体识别各种细菌，而且可以用过DNA核酶的变化产生可检测的荧光信号，特异性地报告是否出现某一特定细菌。
附图说明
[0028]1、图1是的制备以及其使用原理图。
[0029]2、图2是的表征结果图。
[0030]3、图3是用于大肠杆菌和金黄色本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA修饰胶体化巨噬细胞的制备方法，其特征在于，具体如下：将巨噬细胞经平板培养密度后达70％～85％后，加入磁性氧化铁纳米颗粒溶液继续孵育一段时间，待细胞吞噬磁性颗粒后，消化获得悬浮磁化细胞；将光引发剂2
‑
羟基
‑4’‑
(2
‑
羟基乙氧基)
‑2‑
甲基丙苯酮与聚乙二醇二丙烯酸酯混合，制备凝胶液；然后，在细胞悬液中加入一定浓度的凝胶液，孵育后，低速离心收集细胞，并用磷酸缓冲液重悬细胞，使用波长为365nm的紫外灯照射细胞，引发聚合反应，获得胶体化的巨噬细胞；将DNA核酶链与胶体化巨噬细胞孵育，通过磁分离去除多余的DNA，并将得到的保存在4℃中以供后续使用，所述DNA核酶/底物链的终浓度为50～250nM，与胶体化巨噬细胞孵育时间为15～20分钟；所述反应缓冲液组分为1
×
PBS。2.如权利要求1所述的一种DNA修饰胶体化巨噬细胞的制备方法，其特征在于，所使用的磁性氧化铁纳米颗粒浓度为40～70μg/mL，与巨噬细胞孵育8～24小时。3.如权利要求1所述的一种DNA修饰胶体化巨噬细胞的制备方法，其特征在于，所述凝胶液中聚乙二醇二丙烯酸酯浓度为5～10wt％，分子量范围为500～1000Da。4.如权利要求1所述的一种DNA修饰胶体化巨噬细胞的制备方法，其特征在于，所述光引发剂2
‑
羟基
‑4’‑
(2
‑
羟基乙氧基)
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李超，桂悦悦，倪敏，汪丽，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：