一种用于肺癌患者筛查的多基因联合检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于肺癌患者筛查的多基因联合检测试剂盒，其中包括检测SHOX2基因甲基化的试剂，其引物探针组为SEQ ID No:1

【技术实现步骤摘要】
一种用于肺癌患者筛查的多基因联合检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及到一种用于肺癌患者筛查的多基因联合检测试剂盒。
[0002]背景资料肺癌是目前中国乃至全世界发病率、死亡率最高的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的生命健康和生活质量。而且在全球范围内，肺癌新发病例和死亡人数还在逐年增加。特别是在我国，快速发展的工业化进程带来的大气环境污染，叠加全球最高的烟草流行率和人口老龄化等因素的影响，使得我国肺癌发病率和死亡率越来越高。根据国家癌症中心2022年发布的统计数据：2016年我国肺癌新发病例数为82.8万人，居恶性肿瘤首位，占各类型癌症发病总数的20%。同期，我国肺癌患者死亡人数为65.7万人，居恶性肿瘤首位，占各类型癌症死亡总数的27%。
[0003]由于肺癌发病较为隐匿，接近90%的患者在确诊时就已经是中晚期了，很难采取有效的治疗手段，导致其五年生存率不足20%。但对于早期肺癌患者，有数据表明，在接受手术和药物治疗后，其五年生存率高达60%以上。因此，对肺癌高风险人群定期开展早期筛查具有重要的临床意义。
[0004]当前，最常用的肺癌筛查技术是低剂量螺旋CT (low
‑
dose computed tomography, LDCT)。2011年，美国国家癌症研究所采用LDCT对53454例肺癌高风险人群进行大规模随机筛查，结果发现当年肺癌患者的死亡率下降了20%，验证了该技术的有效性，并一直沿用至今，使得美国肺癌患者的死亡率从与我国持平，到如今只有我国的一半左右，显著改善了美国肺癌患者的生存率。
[0005]然而也有研究表明，LDCT不仅会对人体有辐射等不良影响，同时还存在着过度诊断的风险，尤其是对于肺结节良恶性的鉴别时，常常无法做出准确的判断，造成了高达96.0%的肺癌假阳性率。因此，美国胸科协会发表专家共识称需要结合影像学检查和血液标志物检测的策略才能更加科学、合理的进行肺癌筛查。只是传统的蛋白标志物CEA、SCC等，对早期肺癌的灵敏度极低，亟需开发出新的肺癌标志物。
[0006]近年来，随着分子生物学研究的不断深入，科研人员发现抑癌基因异常高甲基化在癌症的发生、发展过程中发挥了重要的作用，因而认为其是一种有前景的生物标志物。特别是在结直肠癌早期筛查领域，目前已有多家上市公司取得了国内外监管机构颁发的三类医疗器械注册证书，通过检测粪便中脱落细胞的基因组DNA或者检测血液中游离的循环肿瘤DNA (Circulating tumor DNA, ctDNA)中Septin 9、SDC2等基因的甲基化状态，进而筛查结直肠癌，其临床性能完全不弱于金标准“肠镜”。
[0007]在肺癌筛查领域，虽然国内外已有三款甲基化检测试剂盒上市，但对于早期肺癌患者的灵敏度依旧不超过20%。而且，这三款试剂盒在检测靶标上的同质化十分严重，均为SHOX2、PTGER4、RASSF1A基因中的两种或三种。有研究表明，除了SHOX2基因的甲基化状态与肺癌的发生发展强烈相关之外，联合检测PTGER4和RASSF1A基因甲基化状态并不会显著增加肺癌患者的检出率。因此，亟需开发出新的甲基化标志物，联合SHOX2基因甲基化筛查肺
癌。

技术实现思路

[0008]为了解决现有肺癌筛查技术所存在的问题，本专利技术新开发了一种多基因联合检测试剂盒，其不仅能够简单、快速的从血液样品中获得大量游离DNA，而且对于早期肺癌患者的灵敏度和特异性分别高达87.5%和95.0%，显著高于其他肺癌肿瘤标志物，适于临床上推广应用。
[0009]具体来说，本专利技术涉及以下内容：一种用于肺癌筛查的多基因联合检测试剂盒，包括检测SHOX2、SCT、HOXA7基因的引物探针组中的一个或多个，其序列如SEQ ID NO:1
‑
9所示。
[0010]优选地，联合检测试剂中还包含检测人内参基因18S的引物探针组，为SEQ ID NO:10
‑
12所示序列。
[0011]一种用于肺癌筛查的多基因联合检测试剂盒，包括检测SHOX2、SCT、HOXA7基因一个或多个甲基化检测试剂的检测区域，其核苷酸序列依次如序列13、序列14和序列15所示。
[0012]一种用于肺癌筛查的多基因联合检测试剂盒，还包括以下组成部分：（1）PCR预反应体系，由DNA聚合酶预混液、引物探针组组成；（2）阴性质控品，即无菌蒸馏水；（3）阳性质控品，经过亚硫酸氢盐转化后的A549细胞基因组DNA。
[0013]优选地，所述PCR预反应体系总体积为21 μL，拟加入待检测DNA模板量为9 μL，组成共30 μL的PCR反应体系。
[0014]更优选的，其中所述DNA聚合酶预混液中包含DNA聚合酶、dNTPs、Mg
2+
离子；所述引物探针组中包含针对人SHOX2基因甲基化的上游引物、下游引物和探针浓度比例为2:2:1，(例如，设计PCR扩增体系上游引物、下游引物和探针终浓度为0.2 uM、0.2 uM、0.1 uM)；和/或针对人SCT基因甲基化的上游引物、下游引物和探针浓度比例为2:2:1，(例如，设计PCR扩增体系上游引物、下游引物和探针终浓度为0.2 uM、0.2 uM、0.1 uM)；和/或针对人HOXA7基因甲基化的上游引物、下游引物和探针浓度比例为2:2:1，(例如，设计PCR扩增体系上游引物、下游引物和探针终浓度为0.2 uM、0.2 uM、0.1 uM)；和/或针对人18S基因甲基化的上游引物、下游引物和探针浓度比例为2:2:1，(例如，设计PCR扩增体系上游引物、下游引物和探针终浓度为0.2 uM、0.2 uM、0.1 uM)。
[0015]本专利技术中，PCR反应温度与反应时间为58~62 ℃退火、延伸10~45s；进一步 优选地， PCR反应温度与反应时间为60 ℃退火、延伸20 s。
[0016]此外，所述试剂盒中还包括（但不限于）：空白对照，以及阴、阳性质控品和说明书。其中，空白对照为无菌蒸馏水，以及阴性质控品为经过亚硫酸氢盐转化后的浓度为1000拷贝每微升的白细胞基因组DNA，阳性质控品为浓度为1000拷贝每微升的肺腺癌细胞系A549细胞基因组DNA。
[0017]一种用于肺癌筛查的多基因联合检测试剂盒，所述SHOX2、18S、SCT、HOXA7基因联合检测试剂中的TaqMan水解探针按先后顺序分别在其探针的5
’
端和3
’
端分别标记了不同的荧光信号和淬灭信号。
[0018]优选地，所述针对人SHOX2基因甲基化的探针，其5
’
端和3
’
端分别标记了FAM荧光
信号和MGB淬灭信号；针对人SCT基因甲基化的探针，其5
’
端和3
’
端分别标记了VIC荧光信号和BHQ1淬灭信号；针对人HOXA7基因甲基化的探针，其5
’
端和3
’
端分别标记了ROX荧光信号和BHQ2淬灭本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于肺癌患者筛查的多基因联合检测试剂盒，其特征在于，包括：检测基因SHOX2、SCT、HOXA7中任意一个或多个甲基化的检测试剂。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括：检测人内参18S基因的检测试剂，为SEQ ID NO: 10
‑
12所示序列。3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，检测人SHOX2基因甲基化的检测试剂，为SEQ ID NO: 1
‑
3所示序列；检测人SCT基因甲基化的检测试剂，为SEQ ID NO: 4
‑
6所示序列；检测人HOXA7基因甲基化的检测试剂，为SEQ ID NO: 7
‑
9所示序列。4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，包括：基因SHOX2、SCT、HOXA7中任意一个或多个甲基化检测试剂的检测区域，该区域所包含的核苷酸序列依次如SEQ ID NO: 13
‑
15所示。5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括：PCR预反应体系，由 DNA聚合酶预混液、0.1
‑
0.4 μmol的引物探针组组成，加入待测DNA模板后组成PCR反应体系。6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括：空白对照，以及阴性和阳性质控品；空白对照为无菌蒸馏水，阴性质控品为经过亚硫酸氢盐转化后的白细胞基因组DNA，阳性质控...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡子健，
申请(专利权)人：卡秋江苏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：