一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基制造技术

本发明专利技术提供了一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基，属于间充质干细胞技术领域。本发明专利技术所提供的培养基的有效成分为Pleurocidin多肽，并辅以DMEM培养基，并且在该培养基中Pleurocidin多肽的使用浓度为4

【技术实现步骤摘要】
一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基


[0001]本专利技术属于间充质干细胞
，尤其涉及一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基。

技术介绍

[0002]骨髓间充质干细胞是一种起源于中胚层的具有自我更新和多项分化潜能的干细胞。其增殖能力强，分化谱系多，在不同的诱导条件下分化为成骨细胞，软骨细胞，肌细胞，基质细胞，神经细胞。骨髓间充质干细胞在骨稳态的维持中发挥着重要的作用，骨稳态的实现是通过破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨形成来实现平衡的。当骨形成不足的时候，就会出现严重的骨量流失导致骨质疏松。现有的研究表明通过将骨髓间充质干细胞注射至骨质疏松动物模型中可以缓解骨丢失。但是，目前仍然存在着成骨效率低下的缺点，因此提高骨髓间充质干细胞的成骨能力是目前需要解决的问题。
[0003]Pleurocidin 是从 Pleuronectes americanus 的表皮中分离出来的天然多肽。其氨基酸序列为：GWGSFFKKAAHVGKHVGKAALTHYL。其具有较为广谱的抗菌活性，能够抵抗多种细菌和真菌。其但是，关于葫芦素B是否在骨髓间充质干细胞成骨中发挥作用尚无文献报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基，从而更好的实现间充质干细胞的成骨分化和应用。
[0005]为了实现上述目的，第一方面，本申请提供了一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基,其特征在于所述培养基中有效成分为Pleurocidin多肽，辅以DMEM培养基。
[0006]优选地，所述培养基中Pleurocidin多肽的含量为4
µ
g/ml
‑
32
µ
g/ml。
[0007]优选地，所述培养基促进骨髓间充质干细胞中ALP酶活性。
[0008]优选地，所述培养基促进骨髓间充质干细胞中细胞钙化。
[0009]优选地，所述培养基促进骨髓间充质干细胞中RUNX2和OCN的表达。
[0010]优选地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
[0011]第二方面，本专利技术提供了Pleurocidin多肽在制备促进间充质干细胞成骨分化培养基中的应用。
[0012]优选地，所述培养基中Pleurocidin多肽的含量为4
µ
g/ml
‑
32
µ
g/ml。
[0013]优选地，所述培养基促进骨髓间充质干细胞中ALP酶活性。
[0014]优选地，所述培养基促进骨髓间充质干细胞中细胞钙化。
[0015]优选地，所述培养基促进骨髓间充质干细胞中RUNX2和OCN的表达。
[0016]本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种新的可以有效促进骨髓间充质干细胞成骨分化的培养基，该培养基由Pleurocidin多肽和DMEM培养基组成，当Pleurocidin多肽的浓度在4
µ
g/ml
‑
32
µ
g/ml
之间时可以在成骨分化诱导过程中有效的促进骨髓间充质干细胞中RUNX2和OCN的mRNA表达；同时，可以有效的促进骨髓间充质干细胞中ALP酶的活性和细胞的钙化。
附图说明
[0017]图1为Pleurocidin多肽预处理后，骨髓间充质干细胞成骨分化时的ALP酶的染色和定量结果；图2为为Pleurocidin多肽预处理后，骨髓间充质干细胞成骨分化时的细胞茜素红的染色和定量结果。
具体实施方式
[0018]所举实施例是为了更好地对本专利技术进行说明，但并不是本专利技术的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述
技术实现思路
对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本专利技术的保护范围。
[0019]实施例1（1）将Pleurocidin多肽使用无血清的DMEM培养基配置成，2
µ
g/ml，4
µ
g/ml，8
µ
g/ml，16
µ
g/ml,32
µ
g/ml，64
µ
g/ml,128
µ
g/ml的多肽溶液；（2）将P3代的骨髓间充质干细胞接种于96孔板中，每孔为1000个细胞，100
µ
l；（3）过夜培养后，去除培养基，使用配置好的多肽溶液分别处理细胞，每种浓度设置3个重复，同时设置不含多肽的对照组；（4）培养48h后，参照CCK
‑
8检测说明书，检测各浓度在450nm的吸光度，得到的结果如表1所示。
[0020]表1 Pleurocidin多肽处理后的细胞增殖情况Pleurocidin多肽浓度吸光度对照组0.555
±
0.0312
µ
g/ml0.567
±
0.0294
µ
g/ml0.573
±
0.0308
µ
g/ml0.579
±
0.02116
µ
g/ml0.574
±
0.01232
µ
g/ml0.544
±
0.02364
µ
g/ml0.484
±
0.026*128
µ
g/ml0.438
±
0.034*从表1中，我们可以得出如下结论：当多肽浓度为2
‑
32
µ
g/ml时，多肽对于骨髓间充质干细胞的增殖没有显著的影响，当多肽浓度为64和128
µ
g/ml时，长时间的处理会对细胞产生一定程度的抑制作用。
[0021]实施例2（1）设计并合成成骨分化相关基因RUNX2和OCN的引物，具体的引物序列如下:RUNX2的上游引物序列为：5
’‑
cttcaaggtggtagccctcg
‑3’
（SEQ ID NO.1）；RUNX2的下游引物序列为：5
’‑
taacagcagaggcattccgg
‑3’
（SEQ ID NO.2）；OCN的上游引物序列为：5
’‑
tgaagagacccaggcgcta
‑3’
（SEQ ID NO.3）；
OCN的上游引物序列为：5
’‑
cacagtccggattgagctca
‑3’
（SEQIDNO.4）；（2）将P3代的骨髓间充质干细胞接种于6孔板中，待细胞密度达到80以上的时候，分别使用2
µ
g/ml，4
µ
g/ml，8
µ
g/ml，16
µ
g/ml,32
µ
g/ml的多肽溶液对细胞处理48h；（3）去除培养基，加入成骨分化培养基，在7d提取RNA检测RUNX2和OCN的mRNA表达水平，得到的结果如表2和表3所示。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基,其特征在于所述培养基中有效成分为Pleurocidin多肽，辅以DMEM培养基。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基中Pleurocidin多肽的含量为4
µ
g/ml
‑
32
µ
g/ml。3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基促进骨髓间充质干细胞中ALP酶活性。4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基促进骨髓间充质干细胞中细胞钙化。5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基促进骨髓间充质干细胞中RUNX...

【专利技术属性】
技术研发人员：王禄，姚成岭，文学军，黄好学，
申请(专利权)人：山东科金生物发展有限公司，
类型：发明
国别省市：