基于脂肪干细胞软骨诱导分化生成类软骨生物材料的制备方法技术

本发明专利技术公开了基于脂肪干细胞软骨诱导分化生成类软骨生物材料的制备方法，包括制备脂肪干细胞悬液，制备无血清培养诱导液，将高密度聚乙烯材料放在培养皿中，将脂肪干细胞悬液加到高密度聚乙烯材料表面，直至溢出高密度聚乙烯材料的边缘，待脂肪干细胞贴壁后再加入培养液和无血清培养诱导液进行共培养，观察并取样检测脂肪干细胞生长分化情况，符合预设要求时即获得成品。本发明专利技术中，脂肪干细胞分离后与高密度聚乙烯材料共培养，并联合使用PRP和TGF

【技术实现步骤摘要】
基于脂肪干细胞软骨诱导分化生成类软骨生物材料的制备方法


[0001]本专利技术涉及类软骨生物材料制备
，特别涉及基于脂肪干细胞软骨诱导分化生成类软骨生物材料的制备方法。

技术介绍

[0002]脂肪干细胞（ADSC）是存在于脂肪组织中的ASC，是继骨髓基质干细胞后在干细胞领域展开广泛研究的一类成体干细胞。脂肪组织在人体分布广泛，来源充足，易于获取，是理想的种子细胞来源。ADSC因其来源可靠，并具有多向分化潜能是现今种子细胞领域研究的热点之一。有学者发现脂肪干细胞贴壁能力强，体外易于培养，营养需求低，在基础培养基中生长旺盛，体外倍增时间约16h
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48h左右可传代，快于同步培养的骨髓基质干细胞。与骨髓基质干细胞相比，脂肪干细胞可能更易于在体外培养中大量扩增，从而获得足够的细胞量以满足实验及临床应用的需要。
[0003]富血小板血浆（PRP）中含有大量的生长因子如血小板源性生长因子（PDGF）、转化生长因子β（TGF
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β）、胰岛素样生长因子1（IGF
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1）等，可用于修复小面积的骨缺损，促进骨质的生长。PRP促进骨再生的主要机制是它能为骨缺损的局部微环境释放一些生长因子，其中发挥主要作用的生长因子是存在于α颗粒中的PDGF和TGF
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β。α颗粒中的TGF
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β大多以其前体形式存在，当机体局部受创时，其前体通过胞吐途径并被一些相关酶激活转变成为活性TGF
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β。TGF
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β是目前公认的能够诱导脂肪干细胞转化为软骨细胞的诱导剂，其中TGF
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β1和TGF
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β3均能够有效诱导脂肪干细胞转化为软骨细胞。
[0004]高密度聚乙烯（medpor）的孔径较大，平均在150μm以上，孔的容积在50%左右，是目前国内外安全运用比较广泛的修复材料，与其它假体比较，具有组织相容性好、感染率低和排斥反应轻等优点，并且能够随意修整和塑形。但高密度聚乙烯因为质地较硬，对软组织和皮肤的压迫作用容易导致假体外露，甚至导致修复失败。软骨材料在整形外科广泛应用，特别是鼻整形，但软骨材料来源受限，并在术后存在吸收变形等问题，需要再次手术修复。

技术实现思路

[0005]（一）要解决的技术问题本专利技术可以解决现有的软骨材料，存在术后软骨吸收变形的难题。
[0006]（二）技术方案为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案，基于脂肪干细胞软骨诱导分化生成类软骨生物材料的制备方法，具体包括如下步骤：S1、自体脂肪组织中提取脂肪干细胞，传代培养后，取4
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6代0.8*106‑
1.2*106个培养后脂肪干细胞，制备脂肪干细胞悬液；S2、按照地塞米松0．1μmol／L、牛血清白蛋白1.25 mg／m1、维生素C 37.5μg／m1、丙酮酸钠1 mmol／L、TGF
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β3 10ng／ml、β
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FGF1ng／m1、ITS 6．25 pg／ml牛胰岛素和6.25μg／ml转铁蛋白和5%PRP制备无血清培养诱导液；
S3、将高密度聚乙烯材料放在培养皿中，将脂肪干细胞悬液加到高密度聚乙烯材料表面，直至溢出高密度聚乙烯材料的边缘，待脂肪干细胞贴壁后再加入培养液和无血清培养诱导液进行共培养；S4、观察并取样检测脂肪干细胞生长分化情况，符合预设要求时即获得成品。
[0007]（三）有益效果本专利技术提供的基于脂肪干细胞软骨诱导分化生成类软骨生物材料的制备方法，脂肪干细胞分离后与高密度聚乙烯材料共培养，并使用PRP提供TGF
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β3的无血清培养基诱导细胞分化为软骨细胞，具有来源广泛，可制备较大量的类软骨材料；细胞来源于自体组织，没有抗原性，组织相容性好；不容易变形，术后效果更好。
附图说明
[0008]图1为倒置相差显微镜观察细胞生长情况图；图2为细胞生长曲线图；图3为不同浓度下脂肪干细胞的成软骨诱导的Alician Blue染色图；图4为不同浓度下PRP的脂肪干细胞增殖实验图；图5为脂肪干细胞与medpor材料立体共培养荧光图；图6为激光共聚焦下细胞在材料上的生长形态图；图7为扫描电镜下高密度聚乙烯及细胞在材料中生长图；图8为RT
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PCR法检测SOX
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9基因及硫酸软骨素基因的表达图；图9为 Westernblot检测SOX
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9和硫酸软骨素的在PRP诱导的脂肪干细胞中的蛋白表达示意图；图10是为模型中老鼠植入材料示意图；图11是模型中对照组示意图；图12为脂肪干细胞及诱导后注入裸鼠皮下后3周SOX
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9和硫酸软骨素的免疫组化表达图。
实施方式
[0009]为使本专利技术实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施方式中的附图，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本专利技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本专利技术保护的范围。
[0010]如图1至图12所示，基于脂肪干细胞软骨诱导分化生成类软骨生物材料的制备方法，具体包括如下步骤：S1、自体脂肪组织中提取脂肪干细胞，传代培养后，取4
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6代0.8*106‑
1.2*106个培养后脂肪干细胞，制备脂肪干细胞悬液；S2、按照地塞米松0．1μmol／L、牛血清白蛋白1.25 mg／m1、维生素C 37.5μg／m1、丙酮酸钠1 mmol／L、TGF
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β3 10ng／ml、β
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FGF1ng／m1、ITS 6．25 pg／ml牛胰岛素和6.25μg／ml转铁蛋白和5%PRP制备无血清培养诱导液；所述TGF
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β3 浓度为10ng／ml制成溶液直接加入提供，PRP经分离后制成溶液中PRP的浓度为5%。
[0011]S3、将高密度聚乙烯材料放在培养皿中，将脂肪干细胞悬液加到高密度聚乙烯材料表面，直至溢出高密度聚乙烯材料的边缘，待脂肪干细胞贴壁后再加入培养液和无血清培养诱导液进行共培养，培养时间为2
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3周；S4、观察并取样检测脂肪干细胞生长分化情况，符合预设要求时即获得成品。
[0012]下面，按照具体的工作步骤进行说明。研究计划的要点为：1、脂肪干细胞的培养，取3
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4代细胞用于实验，观察细胞的生长特性；2、分离富血小板血浆（PRP），使用PRP在脂肪干细胞培养过程中诱导其分化为软骨细胞；脂肪干细胞与高密度聚乙烯的共培养，并在共培养过程中使用PRP诱导脂肪干细胞分化为软骨细胞；3、RT
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PCR及免疫组化检测诱导分化的软骨细胞SOX 抗原及硫酸软骨素的表达；4、体外实验中观察经PRP诱导分化的类软骨生物材料在裸鼠体内的变化，SOX抗原及硫酸软骨素的表达情况。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于脂肪干细胞软骨诱导分化生成类软骨生物材料的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：S1、自体脂肪组织中提取脂肪干细胞，传代培养后，取4
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6代0.8*106‑
1.2*106个培养后脂肪干细胞，制备脂肪干细胞悬液；S2、按照地塞米松0．1μmol／L、牛血清白蛋白1.25 mg／m1、维生素C 37.5μg／m1、丙酮酸钠1 mmol／L、TGF
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β3 10ng／ml、β
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FGF1ng／m1、ITS 6．25 pg／ml牛胰岛素和6.25μg／ml转铁蛋白及5%PRP制备无血清培养诱导液；S3、将高密度聚乙烯材料放在培养皿中，将脂肪干细胞悬液加到高密度聚乙烯材料表面，直至溢出高密度聚乙烯材料的边缘，待脂肪干细胞贴壁后再加入培养液和无血清培养诱导液进行共培养；S4、观察并取样检测脂肪干细胞生长分化情况，符合预设要求时即获得成品。2.根据权利要求1所述的基于脂肪干细胞软骨诱导分化生成类软骨生物材料的制备方法，其特征在于：所述S2中，所述TGF
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β3 浓度为10ng／ml制成溶液直接加入提供，PRP经分离后制成溶液中PRP的浓度为5%。3.根据权利要求1所述的基于脂肪干细胞软骨诱导分化生成类软骨生物材料的制备方法，其特征在于：所述S3中，培养液和无血清培养诱导液进行共培养的时间为2
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3周。4.根据权利要求1或3所述的基于脂肪干细胞软骨诱导分化生成类软骨生物材料的制备方法，其特征在于：所述S5中，观察脂肪干细胞生长分化的方式为：荧光显微镜下观察脂肪干细胞在高密度聚乙烯材料上的生长情况；激光共聚焦下观察脂肪干细胞在高密度聚乙烯材料上的生长形态；扫描电镜下观察脂肪干细胞在高密度聚乙烯材料上的生长形态以及形成的复合生物材料外观。5.根据权利要求1所述的基于脂肪干细胞软骨诱导分化生成类软骨生物材料的制备方法，其特征在于：取样检测脂肪干细胞生长分化的具体的检测步骤为：S41、RT
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PCR法检测SOX
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9及硫酸软骨素表达情况；S42、Western Blot 检测SOX
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9及硫酸软骨素表达。6.根据权利要求5所述的基于脂肪干细胞软骨诱导分化生成类软骨生物材料的制备方法，其特征在于：所述S41中，RT
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PCR法检测SOX
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9及硫酸软骨素表达情况的具体步骤为：S411、SOX
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9的引物：上游：GTACCCGCACCTGCACAAC，下游：TCCGCCTCCTCCACGAAG，扩增片段长度：100bp；硫酸软骨素的引物：上游：ATGGCTTCCACCAGTGCG，下游：CGGATGCCGTAGGTTCTCA，扩增片段长度：127bp；内参照18S rRNA：上游：GACGGACCAGAGCGAAAGC，下游：CGCCAGTCGGCATCGTTTATG，扩增片段长度：119bp；S412、总RNA 提取和测定：采用TRLozL法提取总RNA，分光光度仪测定样品中RNA的含量和纯度；逆转录反应：采用M
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MLV逆转录试剂盒，按照操作说明进行逆转录；S413、PCR反应：按照PREMIX TAQ 12.5μl，模板1μl，目的基因上游引物1μl，目的基因下游引物1μl和ddH2O 9.5μl的组分在冰上配制...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐斌，
申请(专利权)人：扬中市人民医院，
类型：发明
国别省市：