一种蒽降解菌株及其分离筛选方法技术

本发明专利技术一种蒽降解菌株及其分离筛选方法，属于微生物技术领域。蒽降解菌株Pseudomonas stutzeri R4004

【技术实现步骤摘要】
一种蒽降解菌株及其分离筛选方法


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及一种蒽降解菌株及其分离筛选方法。

技术介绍

[0002]蒽作为其具有代表性的有毒的污染物，结构稳定，难以降解，其结构单元同时也存在于致癌性苯并[a]芘(Ba[a]P)和苯并[a]蒽(Ba[a]A)中，故也经常被当作降解PAHs的模型化合物，同时蒽也是检测PAHs污染的指示物。传统PAHs污染土壤修复技术如淋洗法、热处理法等，成本高且易造成二次污染，应用有一定的局限性。生物修复法降解效率高、无二次污染、可原位处理，是未来大范围污染处理的理想方式。现阶段对PAHs污染的生物修复的研究主要涉及降解功能菌株的筛选及降解特性的分析、降解功能基因挖掘、降解途径及机理解析，降解过程代谢中间产物分析，以及人工强化的生物降解调控技术等方面，其中通过人工驯化从环境中分离出修复性能优异的微生物，强化降解污染物菌株的定殖技术和调控技术是生物修复的主流。目前已报道的降解菌大约有200多种，以细菌为主，例如蓝细菌门的蓝细菌属、拟杆菌门的黄杆菌属、厚壁菌门的芽孢杆菌属中均有PAHs降解菌分布。
[0003]目前生物修复法在PAHs污染土壤修复的实际应用上较少，尤其是对蒽污染土壤生物降解的成功案例鲜有报道，主要是由于实验室中筛选或改造的高效降解菌降解效率受环境条件限制严重，仅在其较适宜的环境条件下有较高的PAHs降解速率，施入土壤后受到环境温度、湿度、土著微生物竞争等影响，难以发挥出应有的降解效率，甚至难以在污染土壤中定殖。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在从土壤中分离筛选可以高效降解蒽并可耐受多种PAHs的降解菌，评价其降解效果和在污染土中的定殖能力，并通过多组学结合分析的方式研究降解菌的蒽降解通路，初步解析其降解特性，为PAHs污染土壤的生物修复法提供可利用的微生物资源以及理论基础。
[0005]本专利技术的第一个目的在于公开了一种蒽降解菌株。
[0006]本专利技术的第二个目的在于公开了一种蒽降解菌株的分离筛选方法。
[0007]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种蒽降解菌株Pseudomonas stutzeriR4004
‑
2，CGMCC No.27049。
[0008]上述技术方案所述的蒽降解菌株Pseudomonas stutzeriR4004
‑
2，其中：所述蒽降解菌株Pseudomonas stutzeriR4004
‑
2在肉汤平板培养基上菌落直径在0.25cm左右，呈光滑半透明状，随着培养时间的增长，菌落表面出现皱褶，边缘不平整；革兰氏染色结果为阴性。
[0009]上述技术方案所述的蒽降解菌株Pseudomonas stutzeriR4004
‑
2，其中：Pseudomonas stutzeriR4004
‑
2的固氮酶活性为2.16 nmol C2H4/mg蛋白
·
h。
[0010]上述技术方案所述的蒽降解菌株Pseudomonas stutzeriR4004
‑
2，其中：
Pseudomonas stutzeriR4004
‑
2在肉汤培养基中培养12h时OD600最高，其浓度为109cfu/mL。
[0011]上述技术方案所述的蒽降解菌株Pseudomonas stutzeriR4004
‑
2，其中：蒽降解菌株Pseudomonas stutzeriR4004
‑
2对蒽的降解在第三天的降解效率最高。
[0012]上述技术方案所述的蒽降解菌株Pseudomonas stutzeriR4004
‑
2，其中：蒽降解菌株Pseudomonas stutzeriR4004
‑
2内不含质粒，由一个环形染色体构成，其基因组全长为4,666,542bp，平均G+C含量为63.56%，编码基因4309个。
[0013]上述技术方案所述蒽降解菌株的分离筛选方法，包括下述步骤：（1）、采集北京郊区不同工厂的6个不同点位的土样；（2）、称取10g新鲜土样加入50mL无机盐液体培养基，180转/分培养，10天后取10mL培养液加入含50mg/L萘、菲、蒽、芘混合PAHs的选择培养基中180转/分培养10天；重复上述操作逐步提高PAHs浓度到100mg/L、200mg/L和400mg/L；无机盐液体培养基（g/L）：KH2PO40.5，Na2HPO4·
12H2O 1.0，NH4Cl 1.1，MgSO4·
7H2O 0.2，微量元素溶液2mL，pH=7.3；（3）、取不同浓度驯化培养基的上清，稀释涂布于含50mg/L萘、菲、蒽、芘混合PAHs的选择培养基平皿，28℃倒置培养7天，挑长势较好的单菌落分别在 R2A 平板培养基和肉汤平板培养基上划线培养，纯化 2
‑
3 次，分离出具有PAHs降解潜力的菌株单菌落；取纯化后的菌落在5mL肉汤液体培养基或者R2A液体培养基中培养过夜；（4）、初筛时将得到的菌液按不同的土样、驯化浓度、以及纯化时的培养基进行分组，按分组混合菌液，将1mL菌液加入9mL含50mg/L蒽的选择培养基中培养4天，定量测定样品中蒽的含量，计算得混合菌样的蒽降解率；复筛通过测定初筛中降解率较高的分组中每种单一菌株的降解率，筛选出降解率最高的一株蒽降解菌Pseudomonas stutzeriR4004
‑
2。
[0014]上述技术方案所述的分离筛选方法，其中，步骤（2）中的选择培养基为将PAHs溶于丙酮溶液，过尼龙滤膜除菌，按照浓度计算所需体积加入锥形瓶中，待丙酮挥发完全，加入灭菌后的无机盐液体培养基；步骤（3）中的选择培养基为将PAHs溶于丙酮溶液，过尼龙滤膜除菌，按照浓度计算所需体积加入锥形瓶中，待丙酮挥发完全，加入灭菌后的无机盐培养基，该无机盐培养基在无机盐液体培养基基础上再加入琼脂18
‑
20g。
[0015]上述技术方案所述的分离筛选方法，其中，步骤（3）中的培养基组成为：R2A平板培养基（g/L）：海博R2A液体培养基3.2，琼脂 18
‑
20g；肉汤平板培养基（g/L）：蛋白胨 10.0，牛肉膏 3.0，NaCl 0.5，琼脂 18
‑
20g，pH=7.0~7.2；R2A液体培养基（g/L）：海博R2A液体培养基3.2；肉汤液体培养基（g/L）：蛋白胨 10.0，牛肉膏 3.0，NaCl 0.5，pH=7.0~7.2。
[0016]本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术筛选得到的菌株Pseudomonas stutzeriR4004
‑
2蒽降解效率最高，该菌株且兼具固氮功能，其固氮酶活性为2.16 nmol C2H4/mg蛋白
·
h。
[0017]2、本专利技术方法筛选得到的降解菌Pseudomonas 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蒽降解菌株Pseudomonas stutzeri R4004
‑
2，CGMCC No.27049。2.根据权利要求1所述的蒽降解菌株Pseudomonas stutzeri R4004
‑
2，其特征在于：所述蒽降解菌株Pseudomonas stutzeri R4004
‑
2在肉汤平板培养基上菌落直径在0.25cm左右，呈光滑半透明状，随着培养时间的增长，菌落表面出现皱褶，边缘不平整；革兰氏染色结果为阴性。3.根据权利要求1所述的蒽降解菌株Pseudomonas stutzeri R4004
‑
2，其特征在于：Pseudomonas stutzeri R4004
‑
2的固氮酶活性为2.16 nmol C2H4/mg蛋白
·
h。4.根据权利要求1所述的蒽降解菌株Pseudomonas stutzeri R4004
‑
2，其特征在于：Pseudomonas stutzeri R4004
‑
2在肉汤培养基中培养12h时OD600最高，其浓度为109cfu/mL。5.根据权利要求1所述的蒽降解菌株Pseudomonas stutzeri R4004
‑
2，其特征在于：蒽降解菌株Pseudomonas stutzeri R4004
‑
2对蒽的降解在第三天的降解效率最高。6.根据权利要求1所述的蒽降解菌株Pseudomonas stutzeri R4004
‑
2，其特征在于：蒽降解菌株Pseudomonas stutzeri R4004
‑
2内不含质粒，由一个环形染色体构成，其基因组全长为4,666,542bp，平均G+C含量为63.56%，编码基因4309个。7.权利要求1
‑
6中任一权利要求所述蒽降解菌株的分离筛选方法，包括下述步骤：（1）、采集北京郊区不同工厂的6个不同点位的土样；（2）、称取10g新鲜土样加入50mL无机盐液体培养基，180转/分培养，10天后取10mL培养液加入含50mg/L萘、菲、蒽、芘混合PA...

【专利技术属性】
技术研发人员：马鸣超，姜昕，李俊，朱倬漪，曹凤明，杨小红，关大伟，李力，陈慧君，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，
类型：发明
国别省市：