靶向膜联蛋白A1的纳米抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体及其制备方法与应用，公开了一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体Nb6，其中，所述纳米抗体Nb6的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示，提供的纳米抗体Nb6为与膜联蛋白A1就具有较高的亲和力，通过该抗体可靶向作用于膜联蛋白A1，与膜联蛋白A1高强度的结合能力，有利于开发与膜联蛋白A1的纳米抗体相关药物，实现对肿瘤进行靶向治疗和成像，具有非常大的临床应用价值。同时纳米抗体由于分子量小，可以穿过血脑屏障，将药物或者纳米材料与纳米抗体组装，有望对颅内相关肿瘤进行成像及治疗，应用十分广泛。应用十分广泛。应用十分广泛。

【技术实现步骤摘要】
靶向膜联蛋白A1的纳米抗体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]膜联蛋白A1(annexin A1，ANXA1)是膜联蛋白家族中的一员，又被称为lipocorton
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1，具有独特的结构和功能，ANXA1是一种广泛存在的细胞内外钙、磷脂结合蛋白,属于Ca2+依赖蛋白。ANXA1基因定位于人染色体9q12
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q21.2上，由13个外显子和12个内含子组成，其蛋白质相对分子质量为37 000Da.在结构上,ANXA1具有其家族成员所共有的相似结构：一个高度保守的中心结构域和一个承担各自独特功能的N端序列。ANXA1可参与多种细胞的生理过程：它可在宿主的防御系统中参与调节糖皮质激素相关的抗炎反应,它还参与调节各种炎症反应、细胞增殖、细胞死亡相关信号、细胞分化、凋亡过程及细胞的内吞和分泌的过程。体内外研究表明ANXA1能够抑制细胞生长，抗增殖，调节分化，促进凋亡。ANXA1抗增殖作用主要表现在：通过与不同生长因子蛋白结合，在丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)信号通路上游影响蛋白质复合物的形成和活性来激活ERK1/2MAPK信号级联反应，抑制细胞周期蛋白D1(cyclin D1)表达，从而减少细胞生长；作为EGFR酪氨酸激酶的底物，能够被磷酸化而参与相应的信号转导，抑制EGF介导的增殖反应。ANXA1还能够通过影响细胞凋亡蛋白酶(caspase
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3)的活化和Ca2+的释放，参与激活p38和JNK信号转导，从而促进细胞凋亡。外源性的ANXA1可通过提高胞内Ca2+浓度和Bcl
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2/Bcl
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xL相关凋亡促进因子(Bcl
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2/Bcl
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x L
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associated death promoter,BAD)的去磷酸化而诱导细胞凋亡,外源性的ANXA1可通过提高胞内Ca2+浓度和Bcl
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2/Bcl
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xL相关凋亡促进因子(Bcl
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2/Bcl
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x L
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associated death promoter,BAD)的去磷酸化而诱导细胞凋亡。再者，ANXA1还可以通过调控PLA2的活性，抑制具有抗凋亡作用的前列腺素类因子(如PGE2)的产生，从而促进过氧化氢诱导的细胞凋亡。另外，许多文献表明，ANXA1在许多肿瘤高表达，如在恶性黑色素瘤、胃癌、胶质瘤、乳腺癌，前列腺癌，肺癌等肿瘤中高表达；特别是在上述的肿瘤的血管内皮细胞中大量表达ANXA1，这些发现潜在表明ANXA1可能是治疗或者改善某些炎症和肿瘤等相关疾病的重要靶点，利用这一靶点，可以开发出一系列的肿瘤成像和肿瘤治疗相关药物，从而对肿瘤进行精准诊疗。
[0003]然而，目前没有与ANXA1蛋白高强度结合的纳米抗体，导致ANXA1蛋白有益性质得不到广泛的应用。

技术实现思路

[0004]本申请的目的在于提供一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体及其制备方法与应用，旨在解决现有技术中缺乏可靶向膜联蛋白A1的纳米抗体，以至于无法更好地利用膜联蛋白A1靶点进行相关药物制备的问题。
[0005]为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
[0006]第一方面，本申请提供了一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体Nb6，其中，所述纳米抗体Nb6的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示。
[0007]第二方面，本申请提供了一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：
[0008]将膜联蛋白A1进行表达纯化，得到膜联蛋白A1目的蛋白；
[0009]将所述膜联蛋白A1目的蛋白包被在免疫管上进行富集筛选，得到噬菌体文库；
[0010]将所述噬菌体文库的洗脱液进行PCR扩增并进行ELISA验证，再进行二代测序，并根据测序结果合成纳米抗体的基因序列；
[0011]将所述纳米抗体的基因序列克隆至表达载体中得到重组质粒，将所述重组质粒转入宿主细胞中诱导表达并进行纯化，得到靶向膜联蛋白A1的纳米抗体。
[0012]第三方面，本申请提供了靶向膜联蛋白A1的纳米抗体在制备靶向膜联蛋白A1的相关炎症或免疫治疗的药物中的应用。
[0013]第四方面，本申请提供了靶向膜联蛋白A1的纳米抗体在制备用于肿瘤靶向治疗和成像的药物中的应用。
[0014]本申请第一方面提供的靶向膜联蛋白A1的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体Nb6，其中，所述纳米抗体Nb6的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示，提供的纳米抗体Nb6为与膜联蛋白A1就具有较高的亲和力，通过该抗体可靶向作用于膜联蛋白A1，与膜联蛋白A1高强度的结合能力，有利于开发与膜联蛋白A1的纳米抗体相关药物，实现对肿瘤进行靶向治疗和成像，具有非常大的临床应用价值。同时纳米抗体由于分子量小，可以穿过血脑屏障，将药物或者纳米材料与纳米抗体组装，有望对颅内相关肿瘤进行成像及治疗，应用十分广泛。
[0015]本申请第二方面提供的一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体的制备方法，该制备方法基于噬菌体天然纳米抗体文库，完成三轮对膜联蛋白A1的筛选蛋白，通过ELISA验证，发现一条纳米抗体Nb6，同时与人膜联蛋白A1和鼠膜联蛋白A1均有较高的结合力，因此纳米抗体Nb6有着较好的应用价值，该制备方法快速、简便，有利于大量筛选，提高了筛选效率。
[0016]本申请第三方面提供的靶向膜联蛋白A1的纳米抗体在制备靶向膜联蛋白A1的相关炎症或免疫治疗的药物中的应用，由于得到的靶向膜联蛋白A1的纳米抗体包括纳米抗体Nb6，其对膜联蛋白A1具有高强度的结合能力，因此，可以有利于开发与膜联蛋白A1的纳米抗体相关药物，实现对相关炎症例如骨关节炎等疾病进行预防和治疗，或制备针对膜联蛋白A1设计的各种治疗方法，包括CAR
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T，CAR
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NK，双特异性抗体、纳米抗体偶联药物、纳米材料等相关药物；有利于广泛应用。
[0017]本申请第四方面提供的靶向膜联蛋白A1的纳米抗体在制备用于肿瘤靶向治疗和成像的药物中的应用，由于得到的靶向膜联蛋白A1的纳米抗体包括纳米抗体Nb6，其对膜联蛋白A1具有高强度的结合能力，因此，有利于开发靶向膜联蛋白A1的纳米抗体在制备用于肿瘤靶向治疗和成像的药物中的应用，且基于纳米抗体由于分子量小，可以穿过血脑屏障，将药物或者纳米材料与纳米抗体组装，有利于对颅内相关肿瘤进行成像及治疗。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本
专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括纳米抗体Nb6，其中，所述纳米抗体Nb6的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的靶向膜联蛋白A1的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；所述纳米抗体Nb6中，FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。3.根据权利要求1所述的靶向膜联蛋白A1的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体Nb6的碱基序列如Seq.ID NO.9所示。4.一种权利要求1～3任一所述的靶向膜联蛋白A1的纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将膜联蛋白A1进行表达纯化，得到膜联蛋白A1目的蛋白；将所述膜联蛋白A1目的蛋白包被在免疫管上进行富集筛选，得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙颖，戴凌云，丁有斌，徐小龙，李志杰，王继刚，李金声，李茁，
申请(专利权)人：深圳市人民医院，
类型：发明
国别省市：