一种牛奶外泌体的新型分离方法技术

本发明专利技术提供了一种牛奶外泌体的新型分离方法，属于生物材料分离的技术领域，包括如下步骤：利用沉淀剂对新鲜牛奶进行沉淀处理，去除牛乳蛋白中的酪蛋白，并获得沉淀物质以及中间体；利用直流介电泳微粒分离装置对中间体进行处理，实现对特定电荷微粒的分离，并获得浓缩液；对浓缩液进行稀释，再利用切向流分离装置去除其中的杂蛋白，获得纯净的牛奶外泌体。该联合方法，沉淀过程去除了酪蛋白，介电泳清除了细胞残片及部分杂蛋白，切向流分离二次清除了杂蛋白；耗时短，无常规高速离心过程；间隔式操作方式，方便大批量产业化，直流电介电泳先行处理，从而使后置的切向流处理过程中粒径较单一，分离膜不易堵塞；还可副产品酪蛋白。还可副产品酪蛋白。还可副产品酪蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种牛奶外泌体的新型分离方法


[0001]本专利技术属于生物材料分离的
，尤其是涉及一种牛奶外泌体的新型分离方法。

技术介绍

[0002]外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30
‑
150nm)，现今其特指直径在40
‑
100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，参与细胞间通讯。对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。
[0003]细胞外囊泡(extrace l l u l ar ves i c l es，EVs)凭借良好的结构稳定性、优异的生物兼容性及天然的转运能力，被用于多种癌症的治疗研究，并表现出优于传统纳米药物的疗效。其中，从动物乳汁(如牛奶)等食物提取的细胞外囊泡更具有成本低、易于规模化生产且有潜力作为口服制剂等优势，已有多项研究利用牛奶细胞外囊泡(m i l k
‑
der i ved EVs，mEVs)作为药物载体实现肿瘤的靶向治疗。
[0004]目前现有的牛奶外泌体纯化技术主要有以下几种方法：
[0005]超离法，是最常用的外泌体纯化手段。但是，此种方法产出规模较小，过程比较费时，且回收率不稳定，纯度不能得到保证；另外，此种方法需要重复离心操作，还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。
[0006]密度梯度离心法，在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分离法。但是，此种方法存在的问题是步骤繁琐，耗时。
[0007]超滤离心法，此种方法提取外泌体可能会阻塞过滤孔，导致膜的寿命减短，分离效率较低。
[0008]磁珠法，此种方法提取外泌体效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。
[0009]聚乙二醇(PEG)沉淀外泌体法，此种存在不少问题：比如纯度和回收率低，杂蛋白较多(假阳性)，颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者化学添加物将会破坏外泌体等。

技术实现思路

[0010]有鉴于此，本专利技术旨在提出一种牛奶外泌体的新型分离方法，以缓解上述的技术问题。
[0011]为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0012]一种牛奶外泌体的新型分离方法，包括如下步骤：
[0013]S1:利用沉淀剂对新鲜牛奶进行沉淀处理，去除牛乳蛋白中的酪蛋白，并获得沉淀物质以及中间体；
[0014]S2:利用直流介电泳微粒分离装置对中间体进行处理，实现对特定电荷微粒的分离，并获得浓缩液；
[0015]S3:对浓缩液进行稀释，再利用切向流分离装置去除其中的杂蛋白，获得纯净的牛奶外泌体。
[0016]进一步地，步骤S1包括：
[0017]将新鲜牛奶装入离心瓶进，离心转速为5000r/m i n，离心时间为30m i n，进行离心脱脂；
[0018]用盐酸
‑
磷酸钠或柠檬酸
‑
磷酸氢二钠缓冲液调节脱脂牛奶pH值至4.6
‑
4.8，20
‑
45℃温度区间孵育30m i n
‑
2hrs，进行酪蛋白凝聚；
[0019]然后再3000r/m i n离心，排除乳清蛋白和酪蛋白，时间为15m i n
‑
30m i n。
[0020]进一步地，步骤S2中的直流介电泳微粒分离装置主要由直流电压调节器、金属板和微粒流体分离装置联合构成；
[0021]所述直流电压调节器用于调节所述微粒流体分离装置中的电场强度，电压设定范围为0
‑
500V；
[0022]所述金属板产生静电场电荷，静电场宽度为20
‑
50cm。
[0023]进一步地，步骤S3包括：
[0024]将牛奶外泌体粗提物的浓缩液稀释于PH值4.6
‑
4.8的磷酸氢二钠
‑
柠檬酸缓冲溶中，随后加入切向流分离样品罐；
[0025]启动蠕动泵，通过滤膜即可在终端收集精制外泌体。
[0026]相对于现有技术，本专利技术提供的一种牛奶外泌体的新型分离方法具有以下优势：
[0027]本专利技术提供的一种牛奶外泌体的新型分离方法，沉淀法采用沉淀剂为盐酸
‑
磷酸钠或柠檬酸
‑
磷酸钠复合沉淀剂，利用沉淀剂对新鲜牛奶进行处理，去除牛乳蛋白中的酪蛋白后，获得沉淀与中间体；然后利用直流介电泳微粒分离技术，对中间体进行处理，实现特定大小及特定电荷微粒的分离，获得浓缩液；对浓缩液进行稀释，再利用切向流分离技术除去杂蛋白，即可获得较纯净的牛奶外泌体。该联合方法，相对于其他联合方法的优势：制备的外泌体纯净，无其他杂蛋白(沉淀过程去除了酪蛋白，介电泳清除了细胞残片及部分杂蛋白，切向流分离二次清除了杂蛋白)；耗时短，无常规高速离心过程；间隔式操作方式，方便大批量产业化(直流电介电泳先行处理，从而使后置的切向流处理过程中粒径较单一，分离膜不易堵塞)。还可副产品酪蛋白。
附图说明
[0028]构成本专利技术的一部分的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：
[0029]图1为本专利技术所述的直流介电泳微粒分离过程示意图。
[0030]附图标记说明：
[0031]1‑
直流电压调节器；2
‑
上金属板；3
‑
下金属板；4
‑
外泌体粗提物。
具体实施方式
[0032]下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行
实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。
[0033]下面将结合实施例来详细说明本专利技术。
[0034]一种牛奶外泌体的新型分离方法，包括如下步骤：
[0035]S1:利用沉淀剂对新鲜牛奶进行沉淀处理，去除牛乳蛋白中的酪蛋白，并获得沉淀物质以及中间体；
[0036]S2:利用直流介电泳微粒分离装置对中间体进行处理，实现对特定电荷微粒的分离，并获得浓缩液；
[0037]S3:对浓缩液进行稀释，再利用切向流分离装置去除其中的杂蛋白，获得纯净的牛奶外泌体。
[0038]更为优选地，步骤S1包括：
[0039]将新鲜牛奶装入离心瓶进，离心转速为5000r/m i n，离心时间为30m i n，进行离心脱脂；
[0040]用盐酸
‑
磷酸钠或柠檬酸
‑
磷酸氢二钠缓冲液调节脱脂牛奶pH值至4.6
‑
4.8，20
‑
45℃温度区间孵育30m i n
‑
2hrs，进行酪蛋白凝聚；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛奶外泌体的新型分离方法，其特征在于，包括如下步骤：S1:利用沉淀剂对新鲜牛奶进行沉淀处理，去除牛乳蛋白中的酪蛋白，并获得沉淀物质以及中间体；S2:利用直流介电泳微粒分离装置对中间体进行处理，实现对特定电荷微粒的分离，并获得浓缩液；S3:对浓缩液进行稀释，再利用切向流分离装置去除其中的杂蛋白，获得纯净的牛奶外泌体。2.根据权利要求1所述的一种牛奶外泌体的新型分离方法，其特征在于，步骤S1包括：将新鲜牛奶装入离心瓶进，离心转速为5000r/min，离心时间为30min，进行离心脱脂；用盐酸
‑
磷酸钠或柠檬酸
‑
磷酸氢二钠缓冲液调节脱脂牛奶pH值至4.6
‑
4.8，20
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45℃温度区间孵育30min
‑
2hrs，进行酪蛋白凝聚...

【专利技术属性】
技术研发人员：李志宏，郭雅楠，
申请(专利权)人：天津宏达未来科技有限公司，
类型：发明
国别省市：