用于治疗囊状幼虫病病毒感染的多肽、药物组合物与应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种用于治疗囊状幼虫病病毒感染的多肽、药物组合物与应用。该多肽为SBV药物结合口袋蛋白2的肝素结合基序通过A3替换成碱性氨基酸、N4替换成疏水性氨基酸和/或C末端添加疏水性氨基酸而衍生的多肽。同时本发明专利技术还提供了一种肝素结合基序、多肽、抗血清在制备预防/治疗囊状幼虫病病毒感染的药物、饲料添加剂中的应用，以及肝素结合基序、多肽和抗血清在制备阻断囊状幼虫病病毒感染中蜂幼虫的药物中的应用，本发明专利技术发现肝素结合基序及其衍生肽具有阻断SBV感染中蜂幼虫的作用，为认识SBV

【技术实现步骤摘要】
用于治疗囊状幼虫病病毒感染的多肽、药物组合物与应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于治疗囊状幼虫病病毒感染的多肽、药物组合物与应用。

技术介绍

[0002]囊状幼虫病病毒(Sarbood virus，SBV)是危害蜜蜂健康的昆虫小RNA样病毒(Picorna
‑
like virus)，在世界各国普遍流行。SBV最早发现并流行于西方蜜蜂(Apis mellifera)，1972年首先在广东省佛冈等地引发中华蜜蜂(Apis cerana cerana，简称中蜂)暴发囊状幼虫病，并迅速传播至全国其他地区，给中蜂种群带来毁灭性打击。囊状幼虫病主要危害蜜蜂幼虫，导致幼虫代谢异常和组织损伤，致使幼虫不能发育成蛹，富含SBV颗粒的脱皮液集聚在未脱落的皮肤下，形成囊状。
[0003]在过去的十多年里，SBV在重庆等地流行导致蜂群发病，给蜂业健康发展和蜂农经济效益带来损失。尽管已有换蜂王、RNAi(RNA interference)、药用植物提取物用于防治SBV感染的报道，但这些方法仍有局限性。换蜂王、“囚王断子”等属于蜂病防控的综合管理措施，对养殖技术水平要求较高。RNAi技术用于治疗囊状幼虫病虽有效，但易脱靶可能影响治疗效果。蜜蜂对气味较为敏感，药用植物及用于提取药用植物有效成分的有机溶剂的刺激性气味可能导致蜂群飞逃。另外，对中药有效性影响最大的是中药材的产地，产地不同可能药效差异很大。因此中药制剂的产业化是保障其质量稳定的可靠途径。
[0004]微生物感染的结果在很大程度上取决于病原体利用、破坏宿主成分及其活性的能力。在宿主成分中，氨基葡聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)是病原体的主要靶点。病原体GAG结合位点的功能性保守已被研究证明，病原体几乎在所有感染和发病过程中都使用GAG来促进黏附和侵入宿主细胞。GAG是一种阴离子线性多糖，包括肝素、硫酸乙酰肝素等，由重复的二糖组成，普遍存在于动物细胞表面。GAG在动物组织内的分布存在差异，病原体可能利用1种GAG分子作为黏附受体而实现感染。阻断病原体结合GAG可能阻断感染。针对病原体与宿主细胞表面GAG的结合开发阻断病原体侵入细胞的预防和治疗药物，抗菌肽(Antibacterial pept ide)和抗病毒肽(Antiviral peptides，AVP)是其中一个新研究领域。在实践中，具有生物活性和安全特性的多肽为蜜蜂健康提供了可供选择的治疗措施，并显示出可能成为抗SBV感染的有效药物。
[0005]SBV为单股正链RNA病毒。SBV整个基因组只有1个开放阅读框架(Open Reading Franme，ORF)，其编码的多聚蛋白(Polyprotein)在病毒自身编码的蛋白酶的作用下，氨基端剪切、加工产生成熟的结构蛋白。在哺乳动物小RNA病毒中，每个衣壳蛋白(Capsid protein)含有1个药物结合口袋(Drug
‑
binding pocket)结构域(Domain)，这些蛋白是宿主受体结合部位，可与宿主细胞表面的GAG结合。SBV衣壳蛋白含有小RNA病毒衣壳蛋白药物结合口袋结构域，其中第2个结构域最大。
[0006]目前，本领域技术人员对SBV
‑
GAG相互作用的认识有限，在防治囊状幼虫病方面可使用的有效手段仍有限。因此，需要对SBV
‑
GAG相互作用进行更深入的探索，以开发用于治
疗SBV感染的有效药物。

技术实现思路

[0007]本研究旨在鉴定SBV药物结合口袋蛋白2(Drug
‑
binding pocket protein 2，Dbpp2)的肝素结合基序(Heparin
‑
binding motif)、测定基序及其衍生肽的抗感染活性。本专利研究发现肝素结合基序及其衍生肽具有阻断SBV感染中蜂幼虫的作用，为基于相互作用开发治疗SBV感染的产品提供了支持。
[0008]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一系列基于SBV
‑
GAG相互作用的多肽，该多肽由SBV Dbpp2的肝素结合基序衍生而来，具有溶血活性和抑菌活性，为开发治疗SBV感染的药物提供了支持。
[0009]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]基于SBV
‑
GAG相互作用的多肽，所述多肽为SBV药物结合口袋蛋白2的肝素结合基序通过A3替换成碱性氨基酸、N4替换成疏水性氨基酸和/或C末端添加疏水性氨基酸而衍生的多肽；所述肝素结合基序的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0011]其中，A3表示位于基序第三位的丙氨酸(A)；N4表示位于基序第四位的天冬酰胺(N)。
[0012]进一步，所述碱性氨基酸为精氨酸(R)和/或赖氨酸(K)。
[0013]进一步，所述疏水性氨基酸包括丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸中任一种或多种。
[0014]更进一步，所述疏水性氨基酸优选为丙氨酸和/或色氨酸。
[0015]本专利技术研究发现，肝素结合基序中的R在Dbpp2结合肝素上发挥了关键作用。
[0016]进一步，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5和/或如SEQ ID NO：6所示。
[0017]进一步，所述肝素结合基序和所述多肽具有溶血活性，溶血活性从小到大依次为SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。
[0018]进一步，所述多肽具有抑菌活性，抑菌活性由小到大依次为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。
[0019]进一步，将Dbpp2的肝素结合基序中的A3替换成碱性氨基酸、N4替换成疏水性氨基酸和/或C末端添加疏水性氨基酸可有效提高其溶血活性和抑菌活性。
[0020]所述肝素结合基序和/或所述多肽的体外抑菌活性与溶血活性呈正相关。
[0021]本专利技术的目的之二在于提供一种抗血清，该抗血清可用于治疗囊状幼虫病病毒感染。
[0022]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0023]抗血清，所述抗血清以含有目的一所述的多肽的药物结合口袋蛋白2为抗原免疫小鼠而获得；所述药物结合口袋蛋白2的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
[0024]本专利技术根据大肠杆菌密码子偏好性优化Dbpp2及其突变体的编码基因；在基因的5
’
和3
’
端分别加入BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶识别位点；采用化学合成法合成基因，将其克隆至pGEX
‑
4T
‑
1构建重组表达载体；经IPTG诱导含有重组质粒的大肠杆菌BL21菌株，并从中纯化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于SBV
‑
GAG相互作用的多肽，其特征在于，所述多肽为SBV药物结合口袋蛋白2的肝素结合基序通过A3替换成碱性氨基酸、N4替换成疏水性氨基酸和/或C末端添加疏水性氨基酸而衍生的多肽；所述肝素结合基序的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述碱性氨基酸为精氨酸和/或赖氨酸。3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述疏水性氨基酸包括丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸中任一种或多种。4.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和/或如SEQ ID NO：6所示。5.抗血清，其特征在于，所述抗血清以含有权利要求1所述的多肽的药物结合口袋蛋白2为抗原免疫小鼠而获得；所述药物结合口袋蛋白2的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。6.SBV药物结合口袋蛋白2的肝素结合基序、权利要求1所述的多肽和/或权利要求5所述的抗血清在制备预防和/或治疗囊状幼虫病病毒感染的药物和/或饲料添加剂中的应用，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈克飞，曹兰，徐登峰，许国洋，闫志强，
申请(专利权)人：重庆市畜牧科学院，
类型：发明
国别省市：