一种驼乳源小分子肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种驼乳源小分子肽，小分子肽的氨基酸序列为Pro

【技术实现步骤摘要】
一种驼乳源小分子肽及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种来源于发酵驼乳的小分子肽及其在制备二肽基肽酶Ⅳ抑制剂中的应用。

技术介绍

[0002]糖尿病是目前全球性的公共卫生难题。糖尿病患者长期处于高血糖状态，极易诱发如周围神经病变、血管病变、视觉系统异常、内分泌代谢紊乱等各种并发症，严重影响着患者的身体健康和生活质量。
[0003]糖尿病是由体内胰岛素分泌不足、胰岛素抵抗或两者同时存在而引起血糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱而诱发的慢性代谢性疾病，主要特征是血糖水平长期处于高水平的状态。糖尿病可分为1型糖尿病（Type1 Diabetes Mellitus，T1DM）、2型糖尿病（Type2 Diabetes Mellitus，T2DM）、妊娠糖尿病（Gestational Diabetes Mellitus，GDM）和其他特殊糖尿病，其中患有T2DM的患者约占90％。目前已有多类降血糖药物，例如DPP
‑
4抑制剂类、α
‑
葡萄糖苷酶抑制剂类、胰高血糖素样肽
‑
1受体激动剂类等，其中DPP
‑Ⅳ
抑制剂是较新的靶点药物之一，在临床上已经得到了较好的疗效。但是目前常用的DPP
‑
IV抑制剂多为化学合成，长期服用容易引起会产生如过敏反应、心率失调、上呼吸道感染、胃肠不适等副作用。相比之下，食源性DPP
‑
IV抑制多肽因具有制作方式简便、成本低廉、副作用小等优点，因此人们越来越倾向于预防保健和食疗。乳源中骆驼乳的营养物质含量较高且不含β
‑
乳球蛋白，过敏性较低，易消化、吸收和代谢，据报道酸驼奶对糖尿病具有一定的疗效，而酸驼奶是由乳酸菌和酵母菌共发酵的驼乳制成的，因此酸驼奶是分离纯化DPP
‑Ⅳ
抑制剂的理想蛋白源，并且具有广泛的应用前景。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种小分子肽，其来源于发酵驼乳，该小分子肽的氨基酸序列为Pro
‑
Phe
‑
Pro
‑
Met
‑
Trp
‑
Thr
‑
Phe
‑
Leu
‑
Ser
‑
Arg，分子量为1281.64Da，将其用于制备二肽基肽酶Ⅳ抑制剂，结果表明其具有二肽基肽酶Ⅳ抑制活性。
[0005]本专利技术所述的二肽基肽酶Ⅳ抑制剂的成分（或有效成分）为上述小分子肽，还可以加入一种或多种药物、食品可接受的辅料，以改善药物、食品吸收效果或便于使用，制成适宜的使用剂型，如制成胶囊或丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等，即制成药剂学上适宜的使用剂型，或食品领域适宜的食用方式；可应用于制备治疗或者辅助治疗2型糖尿病的功能食品、保健品和药物。
[0006]本专利技术目的通过如下方案实现： （1）菌种活化：将酵母菌接种至YPD液体培养基中，在22~39℃、60~250rpm下培养8~46h，传2~4代，接种量为体积百分比0.1~4%，活化后菌液的活菌数不少于108CFU/mL，备用，所述酵母菌为单孢酿酒酵母、解脂耶氏酵母、德克酵母、毕赤酵母中的一种或几种；将乳酸菌接种至MRS液体培养基中，在25~40℃、0~150rpm下培养20~72h，传2~4代，接种量为体积百
分比的0.1~4%，活化后菌液的活菌数不少于109CFU/mL，备用，所述乳酸菌为保加利亚乳杆菌、瑞士瑞杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳球菌、嗜热链球菌中的一种或几种；（2）鲜驼乳的发酵：鲜驼乳在60~150℃下灭菌1~30min，降至室温后接种活化好的酵母菌和乳酸菌，接种量为0.1~5%，进行发酵；发酵条件为20～40℃、摇床转速为50~300rpm、发酵时间为12~100h后；发酵完毕的驼乳调节pH至4.0~4.8，在4℃、3000~12000g下离心5~20min，取上清用NaOH调节pH至7.0~8.0，4℃、3000~12000g离心5~20min取上清用冻干机冻干，收集冻干粉；（3）将冻干粉溶于蒸馏水中制得0.05~2g/mL的溶液，用截留量为10kDa及3kDa的截留超滤膜过滤，得到含有分子量>10kDa、3
‑
10kDa、<3kDa组分的溶液，分别冷冻干燥，收集冻干粉，将含有不同组分的冻干粉分别溶于蒸馏水中，检测各组分的二肽基肽酶Ⅳ抑制活性，选择抑制活性最好的液体进行葡聚糖凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP
‑
HPLC）分离纯化，选择RP
‑
HPLC纯化后具有二肽基肽酶Ⅳ抑制活性的峰进行LC
‑
MS鉴定，鉴定后获得的肽序列在BIOPEP进行二肽基肽酶Ⅳ抑制活性预测，选择预测活性最好的进行固相合成验证，最终获得本专利技术的小分子肽。
[0007]本专利技术的优点和积极效果如下：1、本专利技术酸驼奶小分子肽Pro
‑
Phe
‑
Pro
‑
Met
‑
Trp
‑
Thr
‑
Phe
‑
Leu
‑
Ser
‑
Arg（PFPMWTFLSR）可显著抑制二肽基肽酶Ⅳ活性，对二肽基肽酶Ⅳ的抑制率为76%，半抑制浓度（IC50）为0.732 mg/mL，为进一步揭示酸驼奶的降血糖机制提供依据；2、本专利技术酸驼奶小分子肽PFPMWTFLSR改善高糖诱导的Hepg2细胞胰岛素抵抗，改善Hepg2细胞的葡萄糖消耗与葡萄糖摄取；3、本专利技术小分子肽可应用于制备治疗或辅助治疗2型糖尿病的功能食品和保健品，具有制备简单、适用于工业化生产和安全无副作用等优点。
附图说明
[0008]图1为截留超滤膜分离后不同分子量组分的二肽基肽酶Ⅳ的半抑制浓度；图2为葡聚糖凝胶层析色谱分离峰示意图；图3为葡聚糖凝胶层析色谱分离后对应分离峰组分的二肽基肽酶Ⅳ抑制活性检测结果；图4为采用RP
‑
HPLC分离S1峰后的分离峰示意图；图5为RP
‑
HPLC分离后对应分离峰组分的二肽基肽酶Ⅳ抑制活性检测结果；图6为RP
‑
HPLC二次分离后对应分离峰示意图；图7为RP
‑
HPLC二次分离后对应分离峰组分的二肽基肽酶Ⅳ抑制活性检测结果；图8为RP
‑
HPLC三次分离后对应分离峰示意图；图9为RP
‑
HPLC三次分离后对应分离峰组分的二肽基肽酶Ⅳ抑制活性检测结果；图10为D3
‑
2组分的高效液相色谱图；图11为小分子肽PFPMWTFLSR的质谱鉴定图；图12为小分子肽PFPMWTFLSR的酶抑制动力学实验结果，图中0、0.25、0.5mg/mL为小分子肽浓度；图13为小分子肽PFPMWTFLSR对HepG2细胞活性的影响，图中Met为二甲双胍，NT为
阴性对照，IR为模型本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种驼乳源小分子肽，其氨基酸序列为Pro
‑
Phe
‑
Pro
‑
Met
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Trp
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Thr<...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊日布斯，王嘉鑫，严金平，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：