一种利用Fmoc固相合成法制备POCs的方法技术

本发明专利技术属于使用固相合成法制备POCs技术领域，涉及一种利用Fmoc固相合成法制备POCs的方法。针对现有技术中固相合成法无法制备包含精氨酸、组氨酸或色氨酸POCs的技术问题，本申请先将小分子C7NH2偶联到固相载体上，再使用Fmoc

【技术实现步骤摘要】
一种利用Fmoc固相合成法制备POCs的方法


[0001]本专利技术属于使用固相合成法POCs
，具体地，涉及一种利用Fmoc固相合成法制备POCs的方法。

技术介绍

[0002]寡核苷酸有望成为治疗微生物感染和包括癌症在内的人类遗传疾病的有效治疗药物。然而，寡核苷酸作为反义药物存在细胞摄取差、细胞内转运差和对酶降解敏感等缺点，降低了其在体内的有效性。肽与寡核苷酸的共价附着(肽
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寡核苷酸缀合物)可以显著增强其生物学效应。特别是结合多肽以后能有效促进寡核苷酸的跨细胞膜转运，提高外切酶的稳定性。
[0003]在过去的几十年里，科学家们一直致力于开发各种化学方法来合成肽
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寡核苷酸缀合物。目前，合成它们主要有两种方法：一种是组装后结合法，在该策略中，多肽与寡核苷酸被分别合成出来并纯化，然后在溶液中通过化学选择性反应连接形成肽
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寡核苷酸缀合物；另一种是全逐步合成，在同一固体载体上依次合成多肽与寡核苷酸两个片段。与组装后结合的策略相比，全逐步合成只需一次纯化即可快速获得最终产物。然而，全逐步合成的主要问题是多肽和寡核苷酸不兼容，例如，在固相多肽合成结束后，通常需要用三氟乙酸处理以除去多肽侧链的保护基团，而三氟乙酸会造成寡核苷酸上的嘌呤部分脱落。为了避免这个问题，Boc固相合成法被应用于肽
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寡核苷酸缀合物的合成，其多肽侧链上的保护基，如Fmoc，Tfa，For最后用碱来脱除。虽然这种方法最终不需要强酸来去除肽上的保护基，但每次氨基酸偶联时，都需要用强酸来去除α
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Boc保护基，这样的操作具有一定危险性，不如Fmoc固相合成温和。此外，在氨水中过夜反应来脱除侧链保护基，可能会导致肽键断裂。最后，精氨酸胍基上Fmoc保护基会很快被氨水脱除，在氨水中发生脱胍基化反应形成鸟氨酸副产物。Fmoc固相合成法来制备POC时，可以使用烯丙氧羰基(Alloc)和烯丙基(Allyl)保护赖氨酸，谷氨酸，天冬氨酸的侧链，但这个方法需要使用金属催化剂脱除Alloc，Allyl保护基从而导致重金属的残留。并且这种方法也只能用于赖氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，含有精氨酸，组氨酸，色氨酸的POCs由于Alloc，Allyl与Fmoc的脱除条件不兼容仍然无法合成出来。
[0004]肽
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寡核苷酸缀合物的全逐步合成也可以先合成寡核苷酸，再用Fmoc
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氨基酸合成多肽。然而，寡核苷酸合成过程中核苷酸磷酸三脂上的腈乙基保护基与Fmoc的去除条件(20％哌啶)不兼容，因而会使DNA链发生严重的副反应。高度酸不稳定Bpoc和Dde被用于保护氨基酸的α
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氨基，然后被成功应用于肽
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寡核苷酸缀合物的合成。遗憾的是，这种方法中精氨酸和色氨酸与寡核苷酸的兼容性仍然存在问题。更严重的是，由于侧链保护基团的问题，经典的Fmoc固相多肽合成仍然不能很好地用于肽
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寡核苷酸缀合物的合成，目前利用Fmoc固相合成法合成同时含有精氨酸，组氨酸，色氨酸的肽
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寡核苷酸缀合物还无法做到。

技术实现思路

[0005]1.专利技术要解决的技术问题
[0006]针对现有技术中Fmoc法不能用于固相合成制备包含精氨酸、组氨酸或色氨酸的POCs的技术问题，本申请提供一种利用Fmoc固相合成法制备POCs的方法，制备过程在温和条件下的固体支持物上进行，可以手动进行或通过合成仪进行，适用于包含精氨酸、组氨酸或色氨酸的多种肽
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寡核苷酸缀合物的合成。
[0007]2.技术方案
[0008]为达到上述目的，提供的技术方案为：
[0009]本专利技术的一种利用Fmoc固相合成法制备POCs的方法，包括以下步骤：将POCs从固相载体释放并沉淀，使用硼酸盐溶液脱除多肽侧链保护基并纯化POCs；所述POCs包含甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸，或氨基酸类似物中的一种或多种。
[0010]优选的，所述氨基酸类似物为硒半胱氨酸或吡咯赖氨酸。
[0011]进一步地，还包括以下步骤：
[0012]S1，将小分子偶联到固相载体上，所述小分子拥有氨基官能团，所述氨基用Fmoc保护；
[0013]S2，使用Fmoc
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氨基酸进行多肽合成，结束后，在所述多肽上添加一个含羟基的连接臂，羟基用DMTr保护，再进行固相寡核苷酸的合成；
[0014]S3，将POCs从固相载体释放并沉淀，使用硼酸盐溶液脱除多肽侧链保护基并纯化POCs。
[0015]进一步地，
[0016]S1，将小分子偶联到固相载体上，所述小分子同时拥有氨基和羟基两个官能团，所述氨基用Fmoc保护，所述羟基用DMTr保护；
[0017]S2，使用Fmoc
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氨基酸进行多肽合成，再进行寡核苷酸合成；
[0018]S3，将POCs从固相载体释放并沉淀，使用硼酸盐溶液脱除多肽侧链保护基并纯化POCs。
[0019]进一步地，所述硼酸盐溶液为硼酸钠缓冲液，pH值为5.0～9.0；浓度为50～300mM。
[0020]进一步地，所述硼酸钠缓冲液的pH值为8.5；浓度为250mM。
[0021]进一步地，所述小分子为C7NH2。
[0022]进一步地，所述固相载体为可控微孔玻璃珠或树脂。
[0023]进一步地，氨基酸侧链保护基为叔丁氧羰基(Boc)和叔丁基(tBu)。
[0024]优选的，组氨酸的侧链保护基可以用Dmbz代替，但需要在氨水中反应12小时来脱除保护基，条件很剧烈，可能造成肽键的断裂。
[0025]进一步地，使用缩合剂，所述缩合剂为HCTU。
[0026]进一步地，使用高效液相色谱(HPLC)纯化。
[0027]进一步地，使用硼酸盐溶液脱除叔丁氧羰基(Boc)和叔丁基(tBu)的温度为75～95℃，时间为1～8h。
[0028]进一步地，所述POCs包含色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或组氨酸中的一种或多种。
[0029]3.有益效果
[0030]采用本专利技术提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下有益效果：
[0031]本专利技术的一种利用Fmoc固相合成法制备POCs的方法，首先将同时拥有氨基和/或羟基官能团小分子，如C7NH2偶联到固相载体上，所述氨基用Fmoc保护，再使用侧链，如Boc，tBu保护的Fmoc
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氨基酸进行多肽和寡核苷酸合成，最后将POCs从固相载体释放并沉淀，使用硼酸盐溶液脱除保护基团，利用HPLC纯化POCs。Fmoc固相合成法能够高效，快速的获得肽
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寡核苷酸缀合物(POCs)，只需要经历一次HPLC纯化。使用90℃(最佳条件)的硼酸钠缓冲液代替三本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用Fmoc固相合成法制备POCs的方法，其特征在于：包括以下步骤：将POCs从固相载体释放并沉淀，使用硼酸盐溶液脱除多肽侧链保护基并纯化POCs；所述POCs包含甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸，或氨基酸类似物中的一种或多种。2.根据权利要求1所述的一种利用Fmoc固相合成法制备POCs的方法，其特征在于：还包括以下步骤：S1，将小分子偶联到固相载体上，所述小分子拥有氨基官能团，所述氨基用Fmoc保护；S2，使用Fmoc
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氨基酸进行多肽合成，结束后，在所述多肽上添加一个含羟基的连接臂，羟基用DMTr保护，再进行固相寡核苷酸的合成；S3，将POCs从固相载体释放并沉淀，使用硼酸盐溶液脱除多肽侧链保护基并纯化POCs。3.根据权利要求1所述的一种利用Fmoc固相合成法制备POCs的方法，其特征在于：还包括以下步骤：S1，将小分子偶联到固相载体上，所述小分子同时拥有氨基和羟基两个官能团，所述氨基用Fmoc保护，所述羟基用DMTr保护；S2，使用Fmoc
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氨基酸进行多肽合成，再进行寡核苷酸合成；S3，将POCs从固相载体释放并沉淀，使用硼酸盐溶液脱除多肽侧链保护基并纯化POCs。4.根据权利要求1
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3任...

【专利技术属性】
技术研发人员：王涛，周莉，闫小龙，
申请(专利权)人：合肥科生景肽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：