一种定量检测D-二聚体的试剂盒的制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种定量检测D

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测D
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二聚体的试剂盒的制备方法与应用


[0001]本专利技术属于诊断试剂盒
，具体涉及一种宽线性范围全血D
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二聚体免疫层析法检测试剂盒及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]当机体受损伤或其他刺激时，凝血系统将被激活，凝血酶产生，凝血酶将可溶性纤维蛋白原转化为可溶性的纤维蛋白单体，该单体会自动聚合成网状多聚体，在凝血酶和Factor XIIIa因子的作用下单体之间共价交联形成交联纤维蛋白。纤维蛋白的形成触发了纤溶系统的激活和活性纤维蛋白溶解酶(纤溶酶)的产生；后者将交联纤维蛋白降解成不同大小的可溶解的碎片，其中含有其特异降解产物D
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二聚体。D
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二聚体只有在交联型纤维蛋白形成和降解时才能产生，因此D
‑
二聚体是凝血和纤溶系统激活的特异性标记物，也是血栓形成活性的间接标记物。因此D二聚体可反映血栓性疾病的发生和纤溶状态，尤其是非血栓性疾病的阴性排斥反应。
[0003]健康人体内的D
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二聚体水平较低，而在与血栓形成相关的情况下，D
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二聚体水平升高。D
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二聚体水平的升高在血栓开始形成后的2h左右可被检测到，且生成的D
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二聚体在体内的半衰期约为7
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8h，因此快速的D
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二聚体检测十分重要。
[0004]D
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二聚体的检测方法学都是基于抗原
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抗体免疫反应，目前市面上有许多D
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二聚体检测方法，包括全血凝集检测、酶联免疫吸附(ELISA)、化学发光(CLIA)免疫荧光检测(ELFA)、免疫比浊法检测。其中，全血凝集试验灵敏度较低，只能半定量检测；免疫比浊法检测是基于浊度的变化，其样本类型局限为枸橼酸盐血浆，不能进行全血D
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二聚体快速检测；ELISA和CLIA一般包括多步骤的洗脱，操作较为繁琐、费时，很难满足D
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二聚体快速检测；ELFA法可分为定性的胶体金免疫层析法和定量的荧光免疫层析法(LFA)，但胶体金法只能定性检测，且容易受类风湿因子、肝素及血脂的影响，结果准确性差。LFA以荧光材料(荧光素、有色染料如尼罗红、量子点、镧系元素等)作为示踪物，通过仪器检测荧光信号，定量分析D
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二聚体含量，灵敏度高，稳定性好，具有操作简单、检测快速、成本低廉、不需要复杂的操作仪器和专业的操作人员的优点，是实现D
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二聚体快速检测最适合平台。
[0005]但是目前市场上使用的基于LFA的D
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二聚体检测商业试剂盒因Hook效应导致高浓度样本(>10mg/L)测试准确度低。有文献报道，在标记垫下方增加糖处理垫能减缓标记抗体的释放以减轻夹心LFA中的Hook效应，而不需要额外的手动步骤。另有文献提到，可以通过在测试线盒抗原线之间增加抗原线，对三条线的强度产生的数据处理达到消除Hook效应的目的。专利CN109813910A提到利用竞争性免疫反应可以消除钩状效应的方法，即在试剂R1中加入被测对象相对应的抗原或抗体，在试剂R2中加入被测对象对应的抗体或抗原致敏的胶乳颗粒以实现消除Hook的目的。
[0006]而本专利技术是基于双抗体标记同一荧光微球实现消除Hook，即将D
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二聚体单克隆抗体和羊抗鸡IgY多克隆抗体同时偶联在同一Eu
3+
时间分辨荧光微球上形成三元偶联复合物，T线荧光微球捕获量与C线微球捕获量相关联。当测试高浓度抗原样本时，一方面，微球上的
标记抗体与抗原的免疫反应达到饱和，微球
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抗原的二元复合物不再增加；另一方面，未结合在微球的游离抗原被T线上的包被抗体捕获，占据T线抗体捕获位置，使得T线位置的荧光微球捕获量下降，最终T线信号下降。但此时T线位置已经拦截大多数荧光微球，且未在T线捕获的游离微球上也连接了大量抗原，因而该微球
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抗体
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抗原三元复合物的空间位阻增大，使C线对其进一步捕获变得困难，因而C线捕获的荧光微球量下降，最终导致C信号下降幅度明显高于T线，从而使T/C值保持平稳升高的趋势，实现消除Hook效应，机理见图2所示。

技术实现思路

[0007]基于上述背景，本申请提供基于双抗体标记同一时间分辨荧光微球实现消除Hook效应的D
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二聚体免疫层析定量检测试剂盒及其应用，所要解决的技术问题在于现有的D
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二聚体免疫层析检测方法存在Hook效应，高浓度标本检测灵敏度较差，限制了D
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二聚体检测的临床应用。
[0008]为了解决上述技术问题，本申请实施例提供一种定量检测D
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二聚体的试剂盒及其应用，本专利技术的目的至少通过如下技术方案之一实现：
[0009]本专利技术中的方法是将检测抗体1和质控抗体标记在同一时间分辨荧光微球的表面，质控线(C)与检测线(T)共用定量的同一种荧光微球。其消除Hook的原理在于：当抗原浓度太高时，对于单抗体标记荧光微球的免疫层析检测，由于T线抗体被过量的抗原中和，荧光微球捕获量下降，而C线荧光微球捕获量不变，导致检测信号T/C下降，发生Hook；而对于我们的双抗体标记微球免疫层析检测，T线抗体虽然也会被一定的过量抗原中和导致荧光微球捕获量下降，而C线信号由于T线已经捕获了大量荧光微球也呈下降趋势，最终导致T/C维持稳定，抵消Hook。因此，这种双抗体标记方法动态调节了检测线与质控线的荧光强度，使T/C值保持稳定增长，从而有效消除Hook效应，提高检测上限。
[0010]本专利技术提供的一种定量检测D
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二聚体的试剂盒，所述试剂盒包括检测卡，所述检测卡包括卡壳和试纸条，所述试纸条包括PVC底板，所述PVC底板上设置有依次搭接的样品垫、标记垫、缓冲垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸。
[0011]进一步地，样品垫上包被有抗红细胞的抗体，标记垫上包被有荧光微球与抗D
‑
二聚体的单克隆抗体1及羊抗鸡IgY抗体的偶联物，包被膜上包被有抗D
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二聚体的单克隆抗体2作为检测线(T线)、质控线(C线)。
[0012]进一步地，所述样品垫抗人红细胞多克隆抗体溶液的包被浓度0.01
‑
1mg/mL；在一种可选的实施方式中，上述包被浓度优选为0.02
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0.05mg/mL。在上述包被浓度下，可以满足样品垫对于红细胞的高效拦截。
[0013]进一步地，所述标记有D
‑
二聚体单克隆抗体的Eu
3+
时间分辨荧光微球结合物为Eu
3+
时间分辨荧光微球同时偶联抗D
‑
二聚体单克隆抗体1和羊抗鸡IgY抗体的复合偶联物；所述Eu
3+
时间分辨荧光微球的直径为100...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种定量检测D
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二聚体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测卡，所述检测卡包括卡壳和试纸条，所述试纸条包括PVC底板，所述PVC底板上依次搭接的样品垫、标记垫、缓冲垫、硝酸纤维素膜及吸水纸；其中，所述标记垫上吸附有稀土Eu
3+
荧光微球，微球标记有D
‑
二聚体单克隆抗体1以及羊抗鸡IgY抗体；所述硝酸纤维素膜上依次设有检测线和质控线，其中，所述检测线处包被有D
‑
二聚体单克隆抗体2，所述质控线处包被有鸡IgY抗体。2.根据权利要求1所述定量检测D
‑
二聚体的试剂盒，其特征在于，所述标记垫采用如下步骤制得：(1)稀土Eu
3+
荧光微球同时标记抗D
‑
二聚体单克隆抗体1和羊抗鸡IgY抗体，获得抗D
‑
二聚体抗体1和羊抗鸡IgY抗体双标记Eu
3+
荧光微球；(2)将所述D
‑
二聚体抗体1和
‑
羊抗鸡IgY抗体双标记Eu
3+
荧光微球按质量比(0.01
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0.2)：1加入标记稀释液中均匀混合，获得荧光标记混合液；(3)通过非接触式喷金仪将所述荧光标记混合液喷到目标玻璃纤维膜上，将所述玻璃纤维膜进行37
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60℃12
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24h干燥处理，获得所述标记垫。3.根据权利要求1所述的定量检测D
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二聚体的试剂盒，其特征在于，所述样品垫采用如下步骤制得：(1)将玻璃纤维膜浸泡于样品垫处理液中进行浸润处理，使其具有拦截干扰物、调节pH、提高储存稳定性的作用；(2)将浸润处理后的所述玻璃纤维膜进行37
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60℃烘箱干燥12
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24h处理，获得所述样品垫；所述样品垫上包被有兔抗人红细胞多克隆抗体及阻断剂，能够过滤全血样本中红细胞及阻断干扰物质的非特异性干扰；所述兔抗人红细胞多克隆抗体的浓度为0.01
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0.1mg/mL，所述阻断剂为菲鹏生物股份有限公司M005、M009、R001、R009阻断剂，南京京达生物技术有限公司HBR
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5、HBR
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7阻断剂，广州万孚生物技术股份有限公司鼠IgG的一种或多种组合。4.根据权利要求根据权利要求3所述的定量检测D
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二聚体的试剂盒，其特征在于，所述样品垫处理液包括0.4％～0.6％曲拉通X
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305，0.2％～0.5％酪蛋白酸钠，1.5％～5％海藻糖，0.01～0.03M Tris
·
HCl缓冲溶液。5.根据权利要求2所述的定量检测D
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二聚体的试剂盒，其特征在于，所述标记稀释液包括0.5～2.0％吐温
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20，0.5％～2.0％酪蛋白酸钠，20％～30％海藻糖，0.01～0.05M Tris
·
HCl缓冲溶液。6.根据权利要求2所述的定量检测D
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二聚体的试剂盒，其特征在于，所述抗D
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二聚体抗体1和羊抗鸡IgY抗体双标记Eu
3+
荧光微球采用如下步骤制得：(1)将10
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【专利技术属性】
技术研发人员：何小维，张艳妮，王羽，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：