本发明专利技术公开了一种非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡。该试纸卡包括背衬以及在背衬上的样品垫、标记物垫、层析膜和吸水垫。所述层析膜上的检测线喷涂有非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物。该抗原表位多肽组合物为为序列表中序列1所示的多肽、以及序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。所述质控线喷涂山羊抗猪IgG。所得的试纸卡具有极高的灵敏度，同时本发明专利技术所述试纸卡具有极高的特异性及准确性，结果肉眼可判读，较为直观，可快速特异性地检测出血清中非洲猪瘟病毒的特异性抗体，具有良好的实用价值和市场前景。有良好的实用价值和市场前景。
【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡
[0001]本专利技术属于生物检测
，更具体地，本专利技术涉及一种非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡。
技术介绍
[0002]非洲猪瘟(African swine fever,ASF)的病原体是非洲猪瘟病毒(ASFV)，ASFV属于非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)。ASFV是囊膜病毒，正二十面体结构，由5层同心圆结构组成，粒子直径平均为200nm左右，病毒基因组为双链DNA分子，长170
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193kb，编码超过150个多肽，其中至少有50个组成了病毒颗粒的不同结构域。80nm的病毒核心包含病毒基因组和核蛋白p10和pA104R，病毒核心由p35、p15、p150、p37、p34和p14蛋白组成的病毒衣壳包裹；围绕着病毒衣壳的是两层脂质分子，内层囊膜由p54、p17、pE248R和p12组成，衣壳结构含有p72、pE120R和pB438L；病毒通过质膜出芽，从宿主细胞释放，在此过程中获得的外层囊膜包含蛋白p24、CD2v、p30和p12。
[0003][0004]非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征，易感猪群的病死率高达100％。鉴于该病的严重危害性，世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。目前针对ASF没有可用的疫苗，事实上也从未成功研制出过有效的ASF商品化疫苗。对该病的控制严格依赖于动物检疫、生物安全措施和扑杀。研发疫苗面临的技术挑战包括以下几个方面：作为已知最大的DNA病毒之一，ASFV基因尚未鉴定和确定功能；没有可用于疫苗生产的病毒增殖细胞系；具有多个不同表型特征的ASFV基因型，候选疫苗的研发中基本没有交叉保护；研制的疫苗既要可用于家猪注射免疫，同时也可以在丛林传播循环的情况下能够对野猪及潜在的其他野生动物进行口服免疫。动物感染非洲猪瘟病毒后，机体免疫系统对病毒进行免疫防御从而产生特异性抗体，在感染后的2周内，会先后产生IgM和IgG抗体，IgM是免疫系统中最先出现的抗体，检测出IgM提示感染新近发生，一般用于感染的早期诊断，IgG是既往感染的指标，同时进行非洲猪瘟病毒特异性IgM和IgG总抗体有利于提高对非洲猪瘟病毒感染检出的敏感性，此外，还可以用于乳汁、唾液中IgA抗体的检测，因此对有效控制非洲猪瘟病毒具有重要的临床意义。
[0005]非洲猪瘟病毒抗体的检测方法有很多，世界动物卫生组织(WOAH)推荐的诊断技术分为病原学检测和血清学试验。ELISA是WOAH规定的国际贸易检验方法。病毒的分离鉴定与核酸检测，可作为潜伏期、疾病初期及症状明显期的检测手段，主要包括病毒分离试验、红细胞吸附试验、PCR检测、实时荧光定量PCR试验等。血清学试验用于检测非洲猪瘟病毒的抗原和抗体，主要包括荧光抗体技术、ELISA及免疫层析试验等。目前，由于检测需使用活毒，费时费力，病原学检测、荧光抗体技术、免疫学印迹等试验对于技术及设备要求较高，不适于临床推广，ELISA需要专门的实验室才能操作，也限制其在基层中的推广使用。
[0006]胶体金免疫层析技术是一种紧靠肉眼观察即可实现的快速检测技术，操作便捷，反应时间短，不需要任何仪器设备，结果清晰容易辨读，是符合现场检测(POCT)的一种快速检测技术。另一方面，由于目前尚缺少针对非洲猪瘟的商品化疫苗，因此检测出非洲猪瘟病毒抗体，则可以认为猪体内存在非洲猪瘟病毒感染。针对目前非洲猪瘟目前存在隐匿传播的流行趋势，因此对非洲猪瘟病毒特异性抗体检测提出了高敏感性、高特异性的高要求，同时还需要操作便捷，结果判读简单的检测方法，以便可在基层进行推广使用。
技术实现思路
[0007]本专利技术的目的在于提供一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡，该试纸卡利用非洲猪瘟病毒P54蛋白(序列4GenBank No.MH717102)上抗原表位多肽作为检测抗体的特异性抗原，建立了一种特异性、敏感性和重复性好的抗体检测试纸卡，用于检测待测样品中是否含有非洲猪瘟病毒抗体。
[0008]为了达到上述目的，本专利技术首先筛选得到了性能优异的非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物，本专利技术提供的非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2、序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。当所述多肽组合物为序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽中的两种时，两种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1；当所述多肽组合物为序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽中的三种时，任意三种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1：1；
[0009]本专利技术还要求保护非洲猪瘟病毒抗原表位多肽，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽或序列表中序列3所示的多肽。
[0010]本专利技术的检测非洲猪瘟病毒抗体的免疫层析试纸卡，包括背衬以及在背衬上的样品垫、标记物垫、层析膜和吸水垫。所述标记物垫上标记有葡萄球菌A蛋白(SPA)的标记物，，所述层析膜上设置有检测线和质控线，所述检测线(T线)喷涂有上述非洲猪瘟病毒抗原多肽组合物。
[0011]所述层析膜上的质控线(C线)喷涂山羊抗猪IgG；所述非洲猪瘟病毒抗原表位多肽为化学人工合成得到。
[0012]其中，层析膜优选为硝酸纤维素膜(NC膜)。所述的吸水垫的制作材料为吸水滤纸；所述的标记物垫为玻璃纤维素膜。
[0013]所述试纸卡的背衬为聚乙烯背衬。
[0014]所述胶体金免疫层析试纸卡可以用于特异性检测非洲猪瘟病毒抗体，其待测样品包括但不限于猪全血、猪血清、猪血浆、唾液拭子、乳汁等。
[0015]所述试纸卡检测的抗体类别包括但不限于IgG、IgA和IgM等，因此该试纸卡检测的敏感性更高。
[0016]本专利技术试纸卡的定性检测方法及结果判定：
[0017]采用本专利技术试纸卡和本专利技术样品稀释液检测非洲猪瘟病毒抗体的方法，包括如下步骤：
[0018](1)样品处理：待测样品类型包括猪全血、血清、猪血浆、唾液、乳汁等样品。取2滴待测样品(约60μL)加入6滴样品稀释液进行稀释(即进行1:4倍稀释)，作为检测样本。
[0019](2)撕开试纸卡的铝箔袋，取出试纸卡，将其放置在洁净的操作台上。
[0020](3)用巴氏管吸取检测样本，滴加3滴于样品垫上方，垂直缓慢滴加。
[0021](4)滴加完成后，等待10
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15分钟，判定结果。
[0022](5)结果判定：若检测线和质控线均显紫红色，为非洲猪瘟病毒抗体阳性；若检测线不显色而质控线显紫红色，为非洲猪瘟病毒抗体阴性；若质控线不显色，则试纸无效。
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡，其特征在于，包括背衬以及在背衬上的样品垫、标记物垫、层析膜和吸水垫；其特征在于，所述标记物垫包埋有胶体金标记的葡萄球菌A蛋白，所述层析膜上设置有检测线和质控线，所述检测线喷涂有非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物，所述非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。2.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸卡，其特征在于：当所述多肽组合物为序列1所示的多肽、以及序列2所示的多肽和序列3所示的多肽中的一种时，两种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1；当所述多肽组合物为序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽中的三种时，三种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1：1。3.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸卡，其特征在于：所述层析膜上的质控...
【专利技术属性】
技术研发人员：张蕾，董春娜，李静，李鹏宇，吕云杨，肖进，郑妍妍，齐鹏，
申请(专利权)人：中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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