一种用于检测黄曲霉毒素B1的磁分离检测试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测黄曲霉毒素B1的磁分离检测试剂盒和方法，属于生物技术领域。所述磁分离检测试剂盒包括碱性磷酸酶纳米抗体融合蛋白和抗原修饰的磁珠，所述碱性磷酸酶纳米抗体融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述抗原修饰的磁珠为采用完整抗原ABF1修饰在环氧树脂磁珠表面。本发明专利技术基于碱性磷酸酶纳米抗体融合蛋白和抗原修饰的环氧树脂磁珠，开发了一种操作更简单、更快速的黄曲霉毒素B1检测的磁分离竞争性化学发光免疫分析法。该方法可以实现高特异性和高灵敏性检测黄曲霉毒素B1，同时为食品污染物的高灵敏度分析提供快速、简便、可靠的策略，具有重要意义。具有重要意义。具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测黄曲霉毒素B1的磁分离检测试剂盒和方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种用于检测黄曲霉毒素B1的磁分离检测试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]黄曲霉毒素B1(AFB1)是目前已发现的20多种黄曲霉毒素中最主要和最具毒性的一种，它的污染主要出现在热带和亚热带地区。然而，由于气候环境的变化，AFB1污染的区域分布在未来几年可能会增加，这也意味着污染可能发生在许多迄今为止安全的环境中。研究表明，长期接触AFB1会导致人类的癌症、慢性中毒、出生缺陷甚至是基因改变，巨大的经济损失随之而来。由于缺乏高效和稳定的解毒手段，食物链的积累成为上述问题的主要途径。这就加强了对快速检测能力的需求，这种快速和定量的分析对于提供及时的监测或预警具有重要意义。
[0003]通过采用高效液相色谱法、色谱法和质谱法对AFB1进行检测，已经做了大量的工作并取得了一定的成绩。然而，上述方法耗时的预处理步骤和需要专业操作人员使AFB1的检测具有挑战性。利用抗体和抗原特异性结合的免疫测定法由于其普遍适用性、高灵敏度、简单和低成本的优势而被广泛认可和使用。但目前免疫测定的一个主要缺陷是，识别和产生信号需要独立的试剂。这使得标记、固定化或洗涤的程序不可避免，这进一步增加了检测的分析时间。此外，标记和复杂的分析步骤也增加了批次差异和分析误差。抗体是分子识别和检测的核心，在最广泛使用的多克隆抗体(pAb)和单克隆抗体(mAb)中，需要克服一些关键的缺点，包括分子量大、制备过程昂贵、可重复性差和容易失活等。目前利用碱性磷酸酶(ALP)与纳米抗体的融合构建了许多一步免疫分析方法，如伏马菌素B1、猪圆环病毒2型和赭曲霉毒素A。虽然一步免疫分析简化了检测过程，但目标或识别抗体的固定化仍很耗时，因此建立"即插即用"免疫分析的目标要求仍未得到满足。基于以上考虑，亟需提供一种"即插即用"和快速读出的免疫分析方法用于AFB1的检测。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种用于检测黄曲霉毒素B1的磁分离检测试剂盒和方法，以解决上述现有技术存在的问题，基于高耐受性和稳定性的纳米抗体的磁分离竞争性化学发光免疫分析法灵敏快速检测黄曲霉毒素B1，为食品污染物的高灵敏度分析提供快速、简便、可靠的策略，具有重要意义。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0006]本专利技术提供一种用于检测黄曲霉毒素B1的磁分离检测试剂盒，包括：
[0007](1)碱性磷酸酶纳米抗体融合蛋白，所述碱性磷酸酶纳米抗体融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：
[0008]*MTPEMPVLENRAAQGDITAPGGARRLTGDQTAALRDSLSDKPAKNIILLIGDGMGDSEITAARNYAEGAGGFFKGIDALPLTGQYTHYALNKKTGKPDYVTDSAASATAWSTGVKTYNGALGVDIHEKDHPTILEMAKAAGLA
TGNVSTAELQDATPAALVAHVTSRKCYGPSATSEKCPGNALEKGGKGSITEQLLNARADVTLGGGAKTFAETATAGEWQGKTLREQAQARGYQLVSDTASLNSVTEANQQKPLLGLFADGNMPVRWQGPKATYHGNIDKPAVTCTPNPQRNDSVPTLAQMTDKAIELLSKNEKGFFLQVEGASIDKQDHAANPCGQIGETVDLDEAVQRALEFAKKDGNTLVIVTADHAHASQIVAPDTKAPGLTQALNTKDGAVMVMSYGNSEEDSQEHTGSQLRIAAYGPHAANVVGLTDQTDLFYTMKAALGLKGGGGSGGGGSGGGGSVLAALLQGVQAQVQLVDSGGGSVQAGGSLRLSCVASGYTLSNYCMGWFRQVSGKEREGVAGIWTGGGSIWYADSVKGRFTISQDKDKKTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAARWSGSWSGCSGRDYNYWGQGTQVTVSSLEHHHHHH*。
[0009](2)抗原修饰的磁珠，所述抗原修饰的磁珠为采用完全抗原ABF1
‑
BSA修饰在环氧树脂磁珠表面。
[0010]优选的是，所述碱性磷酸酶纳米抗体融合蛋白的合成方法包括以下步骤：将纳米抗体Nb基因和碱性磷酸酶基因通过连接体(G4S)3连接，形成重组基因，再将所述重组基因克隆到表达载体后，转入大肠杆菌表达，即得碱性磷酸酶纳米抗体融合蛋白。
[0011]优选的是，所述重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：
[0012]TAAATGACACCAGAAATGCCTGTTCTGGAAAACCGGGCTGCTCAGGGCGATATTACTGCACCCGGCGGTGCTCGCCGCTTAACGGGTGATCAGACCGCCGCTCTGCGTGATTCTCTTAGCGATAAACCTGCAAAAAATATTATTTTGCTGATTGGCGATGGGATGGGGGACTCGGAAATTACTGCCGCACGCAATTATGCCGAAGGTGCGGGCGGCTTTTTTAAAGGTATCGATGCCTTACCGCTTACCGGGCAATACACTCACTATGCGCTGAATAAAAAAACCGGCAAACCGGACTACGTCACCGACTCGGCTGCATCAGCAACCGCCTGGTCAACTGGTGTCAAAACCTATAACGGCGCGCTGGGCGTCGATATTCACGAAAAAGATCACCCAACGATTCTGGAAATGGCAAAAGCCGCAGGTCTGGCGACCGGTAACGTTTCTACCGCAGAGTTGCAGGATGCCACGCCCGCTGCGCTGGTGGCGCATGTGACCTCGCGCAAATGCTACGGTCCGAGTGCGACCAGTGAAAAATGTCCGGGTAACGCTCTGGAAAAAGGCGGAAAAGGATCGATTACCGAACAGCTGCTTAACGCCCGTGCCGATGTTACGCTTGGCGGCGGTGCAAAAACCTTTGCTGAAACGGCAACCGCCGGTGAATGGCAGGGAAAAACGCTGCGTGAACAGGCACAGGCGCGTGGTTATCAGTTGGTGAGCGATACTGCCTCACTGAATTCGGTGACGGAAGCGAATCAGCAAAAACCCCTATTAGGACTGTTTGCTGACGGCAATATGCCAGTGCGCTGGCAAGGACCGAAAGCAACGTACCACGGTAATATAGATAAGCCCGCAGTCACCTGTACGCCTAATCCGCAACGTAATGACAGTGTACCGACCCTGGCGCAGATGACCGACAAAGCCATTGAATTGTTGAGTAAAAATGAGAAAGGCTTTTTCCTGCAAGTTGAAGGTGCGTCAATCGATAAACAGGATCACGCT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测黄曲霉毒素B1的磁分离检测试剂盒，其特征在于，包括：(1)碱性磷酸酶纳米抗体融合蛋白，所述碱性磷酸酶纳米抗体融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；(2)抗原修饰的磁珠，所述抗原修饰的磁珠为采用完全抗原ABF1
‑
BSA修饰在环氧树脂磁珠表面。2.如权利要求1所述的磁分离检测试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶纳米抗体融合蛋白的合成方法包括以下步骤：将纳米抗体Nb基因和碱性磷酸酶基因通过连接体(G4S)3连接，形成重组基因，再将所述重组基因克隆到表达载体后，转入大肠杆菌表达，即得碱性磷酸酶纳米抗体融合蛋白。3.如权利要求2所述的磁分离检测试剂盒，其特征在于，所述重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。4.如权利要求1所述的磁分离检测试剂盒，其特征在于，所述抗原修饰的磁珠的制备方法包括以下步骤：将环氧树脂磁珠、黄曲霉毒素B1
‑
牛血清白蛋白连接物反应，室温垂直混悬10
‑
15h，采用磁珠封闭缓冲液封闭磁珠的活性位点，获取抗原修饰的磁珠。5.如权利要求4所述的磁分离检测试剂盒，其特征在于，所述环氧树脂磁珠的直径为0.3μm
‑
2.6μm；所述环氧树脂磁珠、黄曲霉毒素B1
‑
牛血清白蛋白连接物的质量比为(10
‑
20)：1。6.一种检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)建立检测系统：将权利要求1中所述碱性磷酸酶纳米抗体融合蛋白、所述抗原修饰的磁珠以及黄曲霉毒素B1标准物在PBS中混合，然后于37℃孵育后，通过磁性吸...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙铁强，王锋，王新阳，郭长江，高蔚娜，姚站馨，虞立霞，张予弦，宁保安，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，
类型：发明
国别省市：