一种跨膜蛋白复合体基因及其在生物发酵制备重组类人胶原蛋白中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种跨膜蛋白复合体基因及其在生物发酵制备重组类人胶原蛋白中的应用，所述跨膜蛋白复合体基因包含三段基因，第一段基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第二段基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，第三段基因选自能够表达分子量在6

【技术实现步骤摘要】
一种跨膜蛋白复合体基因及其在生物发酵制备重组类人胶原蛋白中的应用


[0001]本专利技术属于类人胶原蛋白基因工程领域，尤其涉及一种跨膜蛋白复合体基因及其在生物发酵制备重组类人胶原蛋白中的应用。

技术介绍

[0002]类人胶原蛋白(Human
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like Collagen)是将人体胶原蛋白的其中一段基因通过大肠杆菌、酵母菌等基因工程方法克隆、表达、分离、复性、纯化工艺生产的一种重组蛋白。类人胶原蛋白与人胶原蛋白一样属于结缔组织的重要组成部分，对于维持细胞、组织和器官等的正常生理功能有着重要的作用。由于其具有良好的生物特性，类人胶原蛋白在食品、化妆品、生物学以及医学等方面也都有着广泛的应用。不同于动物材料来源的胶原蛋白，重组人胶原蛋白或类人胶原蛋白不存在动物疾病感染风险。目前市场上已经有许多重组胶原蛋白或类人胶原蛋白由于成分单一、安全性高和生产过程可控等优点已经应用于多个领域，并且也有许多研究报道和许多专利技术专利，因此属于成熟的技术和市场应用领域，只是该成熟技术在生产过程中往往采用常规的比较复杂的离子交换层析或各种介质填料层析分离等重组蛋白分离纯化手段，或者采用大肠杆菌包涵体纯化途径，为了去除杂蛋白和细菌内毒素，纯化或复性过程都比较复杂，而大肠杆菌的分泌表达往往难以达到批量生产的表达量水平，有的酵母分泌表达时候需要采用甲醇诱导，生产成本高于大肠杆菌。而大肠杆菌含内毒素，大肠杆菌胞内含4000多种蛋白，通过包涵体分离纯化十分麻烦，而分泌表达一般指分泌到周质空间或培养液中，周质空间仅有100余种大肠杆菌蛋白，分离纯化简单一些，如果能分泌到培养基中，则分离纯化更简单，尤其是分子量在6
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12kDa这个分子量范围的大肠杆菌发酵液和周质空间中的大肠杆菌杂蛋白极少，更有利于目的蛋白的分离纯化。

技术实现思路

[0003]专利技术目的：大肠杆菌表达重组蛋白大都采用破菌后提取包涵体进行复杂的重组蛋白纯化过程，即使分泌表达大部分也只是分泌到周质空间，分泌表达到发酵液的重组蛋白量往往很少，难以达到规模化产业化生产需求。而重组人胶原蛋白或类人胶原蛋白一般分子量都较大，通常分子量都大于14kDa以上，使之比较容易用大肠杆菌大规模表达和纯化，而分子量比较小的是人胶原蛋白肽，用大肠杆菌表达技术反而有一定难度，表达量低和容易降解，所以通常采用化学合成方法进行，但化学合成胶原蛋白肽生产成本更高。针对这种大肠杆菌重组蛋白表达技术瓶颈和缺陷，针对介于分子量低于12kDa而分子量又大于化学合成的人胶原蛋白肽，针对这些特殊的6
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12kDa的低分子量重组类人胶原蛋白大肠杆菌分泌表达和蛋白纯化技术瓶颈，本专利技术探索了一种不采用大肠杆菌菌体破碎包涵体纯化复性重组蛋白的一般基因工程方法，采用大肠杆菌跨膜蛋白复合体技术将类人胶原蛋白分泌到周质空间和发酵液中，周质空间蛋白与发酵液中蛋白分别纯化或合并纯化，只经过2
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3次不同孔径的工业化陶瓷膜过滤纯化，经过不同浓度硫酸铵沉淀，去盐后就获得电泳纯度符合
使用标准的二种分子量6
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12kDa的重组类人胶原蛋白。
[0004]技术方案：
[0005]第一方面，本专利技术提供了一种跨膜蛋白复合体基因，所述跨膜蛋白复合体基因包含三段基因，第一段基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第二段基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，第三段基因为目的基因，选自能够表达分子量在6
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12kDa类人胶原蛋白的人胶原蛋白基因片段，所述第三段基因位于第一段基因的指定酶切位点前和第3个ATG后所指定的目的基因克隆插入位点，第二段基因位于第一段基因的指定酶切位点后。
[0006]通过上述基因表达的跨膜蛋白复合体将类人胶原蛋白直接分泌到发酵液中，少量分泌到周质空间，菌体内存在的少量重组目的蛋白放弃不用，不破菌以减少大肠杆菌菌体内的内毒素含量的影响。
[0007]作为一种实施方案，所述能够表达分子量在6
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12kDa类人胶原蛋白的人胶原蛋白基因片段，选自核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的基因片段。
[0008]具体的，所述跨膜蛋白复合体基因包含如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2二部分组成的跨膜蛋白复合体基因，从不同的人胶原蛋白基因中选择部分基因片段，合成类人胶原蛋白基因片段插入在SEQ ID NO.1的核酸内切酶BamHI前和SEQ ID NO.1的第3个ATG后所指定的目的基因克隆插入位点，然后在核酸内切酶BamHI后进一步插入含有如SEQ ID NO.2的另一个跨膜蛋白基因，这3个基因(SEQ ID NO.1
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类胶原蛋白基因
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SEQ ID NO.2)共同组成跨膜蛋白复合体通道，这3个跨膜蛋白复合体通道基因一并克隆入一般的pET表达载体，便于将其中表达的类人胶原蛋白分泌到大肠杆菌的周质空间和发酵液中，并且使大部分目的蛋白被分泌入发酵液中。
[0009]进一步的，类人胶原蛋白的基因片段选择不同的人胶原蛋白基因片段，表达的类人胶原蛋白分子量在6
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12kDa之间。类人胶原蛋白的核苷酸序列可以选择为SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6中的一种基因序列，只需要符合人胶原蛋白其中的一段片段，并且能在大肠杆菌中能表达，分子量在6
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12kDa就可以选择用于克隆到含有上述二种跨膜蛋白基因序列的pET表达载体上进行分泌表达和进行简易目的蛋白分离纯化，不同的类人胶原蛋白片段之间表达量会有所不同或纯度有所差别，但是都可以使大部分目的蛋白分泌表达到发酵液中。
[0010]第二方面，本专利技术提供了一种类人胶原蛋白，所述类人胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。
[0011]第三方面，本专利技术提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包括所述的跨膜蛋白复合体基因。
[0012]第四方面，本专利技术提供了一种重组大肠杆菌，所述大肠杆菌包含所述的跨膜蛋白复合体基因，或者表达所述的类人胶原蛋白。
[0013]第五方面，本专利技术提供了一种类人胶原蛋白的制备方法，包括利用所述的跨膜蛋白复合体基因、所述的重组表达载体、或所述的重组大肠杆菌生产类人胶原蛋白。
[0014]进一步的，所述的类人胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0015](1)将所述跨膜蛋白复合体基因连接到pET表达载体上，构建重组表达载体；
[0016](2)将重组表达载体导入到基因克隆用的大肠杆菌感受态中，鉴定，获得含类人胶
原蛋白基因克隆载体的甘油菌，甘油菌测序正确后提取表达质粒转导到大肠杆菌表达菌中，诱导表达；
[0017](3)离心分离大肠杆菌菌体和发酵液，离心后的菌体提取周质蛋白，将发酵本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种跨膜蛋白复合体基因，其特征在于，所述跨膜蛋白复合体基因包含三段基因，第一段基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第二段基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，第三段基因选自能够表达分子量在6
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12kDa类人胶原蛋白的人胶原蛋白基因片段，所述第三段基因位于第一段基因的指定酶切位点前和第3个ATG后所指定的目的基因克隆插入位点，第二段基因位于第一段基因的指定酶切位点后。2.根据权利要求1所述的跨膜蛋白复合体基因，其特征在于，所述能够表达分子量在6
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12kDa类人胶原蛋白的人胶原蛋白基因片段，选自核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的基因片段。3.一种类人胶原蛋白，其特征在于，所述类人胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括权利要求1或2所述的跨膜蛋白复合体基因。5.一种重组大肠杆菌菌株，其特征在于，所述大肠杆菌菌株包含权利要求1或2所述的跨膜蛋白复合体基因，或者表达权利要求3所述的类人胶原蛋白。6.一种类人胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括利用权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐根兴，谢光蓉，查建生，孔凡涛，周旻昱，李子月，
申请(专利权)人：南京斯拜科生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：