一种NMD荧光报告载体系统及其构建方法与应用技术方案

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种NMD荧光报告载体系统及其构建方法与应用。其技术方案包括：包含pcNMD

【技术实现步骤摘要】
一种NMD荧光报告载体系统及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种NMD荧光报告载体系统及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]真核生物中，所有的蛋白质都有对应的编码基因，这些编码基因经过转录形成mRNA，mRNA经过核糖体翻译形成蛋白质，其中mRNA由四种核糖核酸（腺嘌呤核糖核酸A、鸟嘌呤核糖核酸G、胞嘧啶核糖核酸C和胸腺嘧啶核糖核酸U）排列而成。在翻译过程中，tRNA上的反密码子会识别mRNA中的密码子（由三个随机的核糖核酸组成）以匹配特定的氨基酸，从而合成蛋白质。真核生物中一共存在64种密码子对应20中氨基酸，其中终止密码子(UAG、UAA、UGA)不合成氨基酸，是翻译过程的终止信号。
[0003]在基因突变中，有一定概率会导致新的终止密码子的生成，使翻译过程提前终止，这种基因突变称为无义突变。无义突变导致终止密码子（premature termination codon, PTC）提前出现，产生截短蛋白。在真核生物中，为阻止异常截短蛋白的产生，保证细胞正常生理功能，无义突变会激活无义突变介导的mRNA降解发生。mRNA的降解是基因表达过程中一个很重要的调控方式，其中无义介导的mRNA降解是近来发现的一种在真核生物中广泛存在的高度保守的RNA监控机制，可以阻止异常的截断蛋白的产生，保证细胞的正常生理功能，在人类的遗传病和癌症病原学中，扮演了一个很重要的角色。
[0004]明确遗传病的致病基因是实现精准医疗的前提，随着高通量测序技术的完善和测序成本的降低，越来越多的基因突变得以被发现。在这些新发现的突变中，有大量突变因其功能不明而被列为未知意义变异（variants of uncertain significant, VUS），明确这些未知意义变异与遗传病的相关性是基因诊断要解决的重要问题。其中，无义突变的产生是否和疾病发生相关，是否造成NMD，还是会产生无功能或具有正常功能的截短蛋白，这些仍难以检测。因此，如何能快速、高效地在体外对NMD进行验证一直是研究的热点和难点，现有技术中报道的在体外对NMD进行验证的载体系统存在着效率不高、准确性差、检测流程繁琐等问题

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种NMD荧光报告载体系统及其构建方法与应用，解决了以上所述的技术问题。
[0006]本专利技术解决上述技术问题的方案如下：一种pcNMD荧光载体系统，包含pcNMD
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EGFP荧光报告载体和pcNMD
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mCherry荧光报告载体，所述pcNMD
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EGFP荧光报告载体和pcNMD
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mCherry荧光报告载体是由载体pcMINI改造而成，所述pcNMD
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EGFP荧光报告载体和pcNMD
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mCherry荧光报告载体包含CMV增强子、pCMV启动子、外显子A
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内含子A基因片段、多克隆位点1（MCS1）、绿色荧光蛋白EGFP编码基因（pcNMD
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EGFP）或红色荧光蛋白mCherry编码基因（pcNMD
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mCherry）、多克隆位点2（MCS2）和
含正常终止密码子的内含子B
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外显子B基因片段，所述多克隆位点1（MCS1）和多克隆位点2用于在荧光基因前后插入PTC突变附近的编码序列。
[0007]在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。
[0008]进一步，所述多克隆位点1位于荧光蛋白编码基因上游，用于插入PTC突变5
’
侧的部分基因编码序列；所述多克隆位点2位于荧光蛋白编码基因下游，用于插入包含PTC突变位点、PTC突变3
’
侧部分序列及基因正常终止密码子的基因序列。
[0009]pcNMD载体的构建方法，包括如下步骤：S1、以商品化真核表达载体pEGFP
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C1为模板，设计扩增引物，经PCR扩增获得绿色荧光蛋白EGFP的编码DNA片段，然后经EcoRI/EcoRV双酶切插入载体pcMINI多克隆位点区域，获得重组载体pcNMD
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EGFP；S2、以商品化真核表达载体pmCherry
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N1为模板，设计扩增引物，经PCR扩增获得红色荧光蛋白mCherry的编码DNA片段，然后经EcoRI/EcoRV双酶切后插入载体pcMINI多克隆位点区域，获得pcNMD
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mCherry重组载体；S3、将步骤S1和S2中得到的pcNMD
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EGFP重组载体和pcNMD
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mCherry重组载体分别转化至大肠杆菌DH5α感受态细菌，培养后提取重组质粒，即为pcNMD
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EGFP和pcNMD
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mCherry载体。
[0010]在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。
[0011]进一步，步骤S1中，PCR扩增绿色荧光蛋白EGFP编码DNA片段的引物为EGFP
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EcoRI
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F和EGFP
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EcoRV
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R，其序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
[0012]进一步，步骤S2中，PCR扩增红色荧光蛋白mCherry的编码DNA片段的引物为mCherry
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EcoRI
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F和mCherry
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EcoRV
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R，其序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
[0013]进一步，步骤S3中具体方法如下：将得到的pcNMD
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EGFP和pcNMD
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mCherry重组载体通过热激法转化至大肠杆菌DH5α感受态细菌，并通过氨苄青霉素抗性筛选获得阳性重组质粒。
[0014]进一步，阳性重组质粒的筛选方法具体如下：挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm的条件下培养过夜，使用商品化质粒小提试剂盒提取重组pcNMD
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EGFP和pcNMD
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mCherry载体质粒DNA。
[0015]pcNMD
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EGFP和pcNMD
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mCherry载体在体外验证真核生物无义介导的mRNA降解中的应用。
[0016]在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。
[0017]进一步，应用方法包括如下步骤：S101、将突变位点5
’
侧的基因序列插入pcNMD
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EGFP和pcNMD
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mCherry载体的多克隆位点1区域；然后将含有突变位点及正常终止密码子的野生型DNA片段和突变型DNA片段插入pcNMD
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EGFP和pcNMD
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种pcNMD荧光载体系统，其特征在于，包含pcNMD
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EGFP荧光报告载体和pcNMD
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mCherry荧光报告载体，所述pcNMD
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EGFP荧光报告载体和pcNMD
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mCherry荧光报告载体是由载体pcMINI改造而成，所述pcNMD
‑
EGFP荧光报告载体和pcNMD
‑
mCherry荧光报告载体包含CMV增强子、pCMV启动子、外显子A
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内含子A基因片段、多克隆位点1、pcNMD
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EGFP或pcNMD
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mCherry、多克隆位点2和含正常终止密码子的内含子B
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外显子B基因片段，pcNMD
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EGFP用于表达PTC突变型基因序列，pcNMD
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mCherry用于表达未突变的野生型基因序列，所述多克隆位点1和多克隆位点2用于在荧光基因前后插入PTC突变附近的编码序列。2.根据权利要求1所述一种NMD荧光报告载体系统及其构建方法与应用，其特征在于：所述多克隆位点1位于荧光蛋白编码基因上游，用于插入PTC突变5
’
侧的部分基因编码序列；所述多克隆位点2位于荧光蛋白编码基因下游，用于插入包含PTC突变位点、PTC突变3
’
侧部分序列及基因正常终止密码子的基因序列。3.权利要求1～2任一项所述的pcNMD载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、以商品化真核表达载体pEGFP
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C1为模板，设计扩增引物，经PCR扩增获得绿色荧光蛋白EGFP的编码DNA片段，然后经EcoRI/EcoRV双酶切插入载体pcMINI多克隆位点区域，获得重组载体pcNMD
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EGFP；S2、以商品化真核表达载体pmCherry
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N1为模板，设计扩增引物，经PCR扩增获得红色荧光蛋白mCherry的编码DNA片段，然后经EcoRI/EcoRV双酶切后插入载体pcMINI多克隆位点区域，获得pcNMD
‑
mCherry重组载体；S3、将步骤S1和S2中得到的pcNMD
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EGFP重组载体和pcNMD
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mCherry重组载体分别转化至大肠杆菌DH5α感受态细菌，培养后提取重组质粒，即为pcNMD
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EGFP和pcNMD
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mCherry载体。4.如权利要求3所述的pcNMD
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EGFP载体的构建方法，其特征在于，步骤S1中，PCR扩增绿色荧光蛋白EGFP编码DNA片段的引物为EGFP

【专利技术属性】
技术研发人员：杨国华，胡俊，程亚婷，李颖，雷婧雯，邵彤，蔡俊，易红霞，
申请(专利权)人：武汉翼康基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：