一种CRISPR-Cas9基因编辑工具及其编辑方法技术

本发明专利技术公开了一种CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种CRISPR
‑
Cas9基因编辑工具及其编辑方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体为一种CRISPR
‑
Cas9基因编辑工具及其编辑方法。

技术介绍

[0002]基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
[0003]CRISPR
‑
Cas9，一种基因治疗法，这种方法能够通过DNA剪接技术治疗多种疾病。CRISPR
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Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR
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Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是用于基因编辑中前沿的方法。以CRISPR
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Cas9基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。该技术成果已应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。
[0004]小麦是由A、B、D三套基因组组成的异源六倍体，基因的平均拷贝数为2.8个，其中接近一半的基因(46％)有3
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4个拷贝，12％的基因有1
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2个拷贝，42％的基因拷贝数≥5个，因此迫切需要在小麦中建立重组酶介导的基因叠加转基因操作系统，实现DNA叠加/删除，并利用该系统，在小麦中开发具有自主知识产权的目标株系。与传统的基因组编辑技术ZFN和TALEN相比，利用CRISPR
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Cas9定点突变，成本更低，更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，对小麦基因功能的研究具有重要意义。
[0005]现如今小麦等作物中突变率高、获得CRISPR
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Cas9转基因突变株系难，转化时间长，且转化成本较高，因此，本专利技术提出一种CRISPR
‑
Cas9基因编辑工具及其编辑方法，以解决上述提到的问题。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种CRISPR
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Cas9基因编辑工具及其编辑方法，解决了现如今小麦等作物中突变率高、获得CRISPR
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Cas9转基因突变株系难，转化时间长，且转化成本较高的问题。
[0007]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种CRISPR
‑
Cas9基因编辑工具，包括pML
‑
Cas9质粒以及pJM
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sgRNA质粒；所述pML
‑
Cas9质粒包括一个pMV261表达载体、一个TaU3p启动子、一个靶基因序列、一个sgRNA4TmC+5结构、一个Cas9基因和一个NHEJ修复基因，所述pMV261表达载体、TaU3p启动子、靶基因序列、sgRNA4TmC+5结构、Cas9基因和NHEJ修复基因按照上述顺序依次连接，所述pMV261表达载体上的Hsp60启动子被替换为了TaU3p启动子；所述NHEJ修复基因包含编码DNA末端结合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因；所述Cas9基因位于pMV261表达载体的TaU3p启动子的下游以及pMV261表达载
体的rrnB终止子上游，由TaU3p启动子驱动表达，所述pJM
‑
sgRNA质粒依次包含OriM复制子、pMB1复制子、Pj23119启动子、sgRNA序列、rrnB终止子以及aadA抗性基因，所述sgRNA序列是靶向序列，可特异性靶向靶序列；所述靶序列是指需编辑基因的核苷酸序列。
[0008]优选的，所述Cas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]优选的，所述pML
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Cas9质粒以及pJM
‑
sgRNA质粒中的Pj23119启动子的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]优选的，所述TaU3p启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011]优选的，所述sgRNA4TmC+5结构的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0012]优选的，所述DNA末端集合蛋白mku的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0013]本专利技术还公开了一种CRISPR
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Cas9基因编辑工具的编辑方法，具体包括以下步骤:
[0014]S1、质粒导入：先将权利要求1
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6任一所述的一种CRISPR
‑
Cas9基因编辑工具中的pML
‑
Cas9质粒导入小麦中，使得pML
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Cas9质粒上的Cas9基因、编码DNA末端结合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因表达，然后将权利要求1
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5任一所述的一种CRISPR/Cas9基因编辑系统中的pJM
‑
sgRNA质粒导入小麦中；
[0015]S2、基因敲除：需编辑基因的敲除会使得新金色分枝杆菌基因产生DSB断裂，此时，pML
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Cas9质粒上的表达的DNA末端结合蛋白mku以及DNA连接酶LigD会修复DSB断裂，完成小麦基因的编辑过程。
[0016]有益效果
[0017]本专利技术提供了一种CRISPR
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Cas9基因编辑工具及其编辑方法。与现有技术相比具备以下有益效果：
[0018]该CRISPR
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Cas9基因编辑工具及其编辑方法，通过在包括pML
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Cas9质粒以及pJM
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sgRNA质粒；所述pML
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Cas9质粒包括一个pMV261表达载体、一个TaU3p启动子、一个靶基因序列、一个sgRNA4TmC+5结构、一个Cas9基因和一个NHEJ修复基因，所述pMV261表达载体、TaU3p启动子、靶基因序列、sgRNA4TmC+5结构、Cas9基因和NHEJ修复基因按照上述顺序依次连接，所述pMV261表达载体上的Hsp60启动子被替换为了TaU3p启动子；所述NHEJ修复基因包含编码DNA末端结合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因；所述Cas9基因位于pMV261表达载体的TaU3p启动子的下游以及pMV261表达载体的rrnB终止子上游，由TaU3p启动子驱动表达，所述pJM
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sgRNA质粒依次包含OriM复制子、pMB1复制子、Pj23119启动子、sgRNA序列、rrnB终止子以及aadA抗性基因，所述sgRNA序列是靶向序列，可特异性靶向靶序列；所述靶序列是指需编辑基因的核苷酸序列，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR
‑
Cas9基因编辑工具，其特征在于：包括pML
‑
Cas9质粒以及pJM
‑
sgRNA质粒；所述pML
‑
Cas9质粒包括一个pMV261表达载体、一个TaU3p启动子、一个靶基因序列、一个sgRNA4TmC+5结构、一个Cas9基因和一个NHEJ修复基因，所述pMV261表达载体、TaU3p启动子、靶基因序列、sgRNA4TmC+5结构、Cas9基因和NHEJ修复基因按照上述顺序依次连接，所述pMV261表达载体上的Hsp60启动子被替换为了TaU3p启动子；所述NHEJ修复基因包含编码DNA末端结合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因；所述Cas9基因位于pMV261表达载体的TaU3p启动子的下游以及pMV261表达载体的rrnB终止子上游，由TaU3p启动子驱动表达，所述pJM
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sgRNA质粒依次包含OriM复制子、pMB1复制子、Pj23119启动子、sgRNA序列、rrnB终止子以及aadA抗性基因，所述sgRNA序列是靶向序列，可特异性靶向靶序列；所述靶序列是指需编辑基因的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的一种CRISPR
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Cas9基因编辑工具，其特征在于：所述Cas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的一种CRISPR
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Cas9基因编辑工具，其特征在于：所述pML
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Cas9质粒以及pJM
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sgRNA质粒中的Pj23119启动子的基因的核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨国华，胡俊，陈志毅，李婷，张德庆，袁天立，林宝仪，
申请(专利权)人：武汉翼康基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：