一种pcMINI载体及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种pcMINI载体及其构建方法与应用。所述pcMINI载体是由载体pcDNA3.1+改造而成，所述pcMINI载体包含CMV增强子、PCMV启动子、多克隆位点(MCS)、外显子

【技术实现步骤摘要】
一种pcMINI载体及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种pcMINI载体及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]真核生物中，无论是蛋白质还是除mRNA之外的其他RNA分子(如microRNA、cirRNA、lncRNA等)都有对应的编码基因，这些编码基因通常被非编码的间隔序列(内含子)分隔为若干个外显子，上述编码基因也被称为断裂基因。在转录过程中，断裂基因首先被转录为含有外显子和内含子的mRNA前体(precursor messenger RNA,pre
‑
mRNA)，随后mRNA前体经RNA剪接(RNA splicing)，将内含子剪切去除，并将外显子RNA部分有序连接，最终产生成熟的mRNA。RNA剪接是真核细胞基因表达的重要生物学机制，正确的RNA剪接依赖于剪接体(spliceosome)及RNA结合蛋白与mRNA前体顺式作用元件的正确结合。调控RNA剪接的顺式作用元件包括：1)内含子5
’
端的剪接供体(donor)位点GT和内含子3
’
端的剪接受体(acceptor)位点AG；2)近邻内含子的外显子序列，即外显子5
’
端的第1个碱基和3
’
端的最后3个碱基；这两类元件共同构成了外显子内含子接头序列，除了接头序列，基因外显子和内含子区域内部存在的剪接调控元件如增强子和沉默子亦会调控基因的剪接。
[0003]明确遗传病的致病基因是实现精准医疗的前提，随着高通量测序技术的完善和测序成本的降低，越来越多的基因突变得以被发现。在这些新发现的突变中，一部分位于基因编码区的无义突变、错义突变、移码突变等突变因直接影响编码蛋白的结构和功能，其致病性和临床意义能很快明确；但是，还有大量突变因其功能不明而被列为未知意义变异(variants of uncertain significant,VUS)，明确这些未知意义变异与遗传病的相关性是基因诊断要解决的重要问题。目前研究表明，有大量的人类遗传病与mRNA异常剪接有直接关系：外显子内含子接头序列的突变可以导致邻近的内含子滞留或外显子缺失；基因内部突变产生新的接头序列可以导致RNA剪接异常；剪接调控元件序列突变会影响RNA剪接效率，从而影响基因表达水平。因此，如何能快速、高效地在体外对mRNA异常剪接进行验证一直是研究的热点和难点，现有技术中报道的在体外对mRNA异常剪接进行验证的载体系统存在着效率不高、准确性差等问题。

技术实现思路

[0004]针对以上现有技术中的不足，本专利技术提供了一种pcMINI载体及其构建方法与应用。通过克隆带有可能与mRNA剪接相关的基因突变(包括外显子内含子接头序列附近以及深度内含子中的点突变、插入及缺失等变异)的目标基因组片段，构建重组表达载体，转染真核细胞株后进行RT
‑
PCR，再利用琼脂糖凝胶电泳和sanger测序技术验证该突变对mRNA剪接的影响(外显子缺失、内含子滞留)，本专利技术构建的载体能快速、高效并准确的验证一些突变对mRNA剪接异常的影响。
[0005]本专利技术的一个目的在于提供一种pcMINI载体。
[0006]一种pcMINI载体，所述pcMINI载体是由载体pcDNA3.1+改造而成，所述pcMINI载体包含CMV增强子、PCMV启动子、多克隆位点(MCS)、外显子
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内含子基因片段和BGH_PA_terminator终止子，所述多克隆位点(MCS)用于插入外显子
‑
内含子结合处存在突变的基因片段。
[0007]进一步地，所述多克隆位点(MCS)位于所述外显子
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内含子基因片段之间，并且按“外显子A
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内含子A
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MCS
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内含子B
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外显子B”顺序排列，所述内含子A带有mRNA剪切供体(donor)GT，所述内含子B带有mRNA剪切受体(acceptor)AG。
[0008]进一步地，所述外显子A的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述内含子A的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述内含子B的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述外显子B的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0009]本专利技术的另外一个目的在于提供一种pcMINI载体的构建方法。
[0010]上述任一项所述的pcMINI载体的构建方法，包括如下步骤：
[0011]S1、以人基因组DNA为模板，设计扩增引物，经PCR扩增获得“外显子A+内含子A”DNA片段，然后经HindIII/KpnI双酶切插入载体pcDNA3.1+多克隆位点区域，获得重组中间载体pcDNA3.1
‑
A；
[0012]S2、以人基因组DNA为模板，设计扩增引物，经PCR扩增获得“内含子B+外显子B”DNA片段，然后经XhoI/XbaI双酶切后插入步骤S1中得到的pcDNA3.1
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A载体多克隆位点区域，获得pcMINI重组载体；
[0013]S3、将步骤S2中得到的pcMINI重组载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细菌，培养后提取重组质粒，即为pcMINI载体。
[0014]进一步地，步骤S1中，PCR扩增“外显子A+内含子A”DNA片段的引物为pcMINI
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HindIII
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F和pcMINI
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KpnI
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R，其序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
[0015]进一步地，步骤S2中，PCR扩增“内含子B+外显子B”DNA片段的引物为pcMINI
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XhoI
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F和pcMINI
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XbaI
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R，其序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
[0016]进一步地，步骤S3中具体方法如下：将得到的pcMINI重组载体通过热激法转化至大肠杆菌DH5α感受态细菌，并通过氨苄青霉素抗性筛选获得阳性重组质粒。
[0017]更进一步地，所述抗性筛选的具体方法如下：挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm的条件下培养过夜，使用商品化质粒小提试剂盒提取重组pcMINI载体质粒DNA。
[0018]本专利技术的最后一个目的在于提供一种pcMINI载体的应用。
[0019]上述任一项所述的pcMINI载体在体外验证真核生物mRNA异常剪切中的应用。
[0020]进一步地，所述应用方法包括如下步骤：
[0021]S101、分别将含有突变位点的野生型DNA片段和突变型DNA片段插入pcMINI载体的多克隆位点区域，构建表达野生型和突变型基因的重组表达载体；
[0022]S102、将步骤S101中构建的野生型和突变型基因的重组表达载体转染真核细胞，转染本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种pcMINI载体，其特征在于，所述pcMINI载体是由载体pcDNA3.1+改造而成，所述pcMINI载体包含CMV增强子、PCMV启动子、多克隆位点(MCS)、外显子
‑
内含子基因片段和BGH_PA_terminator终止子，所述多克隆位点(MCS)用于插入外显子
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内含子结合处存在突变的基因片段。2.如权利要求1所述的pcMINI载体，其特征在于，所述多克隆位点(MCS)位于所述外显子
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内含子基因片段之间，并且按“外显子A
‑
内含子A
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MCS
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内含子B
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外显子B”顺序排列，所述内含子A带有mRNA剪切供体(donor)GT，所述内含子B带有mRNA剪切受体(acceptor)AG。3.如权利要求2所述的pcMINI载体，其特征在于，所述外显子A的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述内含子A的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述内含子B的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述外显子B的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。4.权利要求1～3任一项所述的pcMINI载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、以人基因组DNA为模板，设计扩增引物，经PCR扩增获得“外显子A+内含子A”DNA片段，然后经HindIII/KpnI双酶切插入载体pcDNA3.1+多克隆位点区域，获得重组中间载体pcDNA3.1
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A；S2、以人基因组DNA为模板，设计扩增引物，经PCR扩增获得“内含子B+外显子B”DNA片段，然后经XhoI/XbaI双酶切后插入步骤S1中得到的pcDNA3.1
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A载体多克隆位点区域，获得pcMINI重组载体；S3、将步骤S2中得到的pcMINI重组载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细菌，培养后提取重组质粒，即为pcMINI载体。5.如权利要求4所述的pcMINI载体的构建方法，其特征在于，步骤S1中，PCR扩增“外显子A+内含子A”DNA片段的引物为pcMINI
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HindIII
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F...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨国华，胡俊，陈志毅，李婷，张德庆，袁天立，林宝仪，
申请(专利权)人：武汉翼康基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：