柑橘黄龙病菌SDE3蛋白抗体在检测柑橘黄龙病中的应用制造技术

本发明专利技术公开了柑橘黄龙病菌SDE3蛋白抗体在检测柑橘黄龙病中的应用，属于分子生物学技术领域。所述SDE3蛋白抗原为A1)或A2)的蛋白质：A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；A2)在A1)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合标签蛋白得到的具有与A1)相同活性的可溶性融合蛋白。本发明专利技术提供的抗体可以简单准确检测出植株是否感染黄龙病菌，可为植株黄龙病菌的检测提供极大的支持。测提供极大的支持。

【技术实现步骤摘要】
柑橘黄龙病菌SDE3蛋白抗体在检测柑橘黄龙病中的应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及柑橘黄龙病菌SDE3蛋白抗体在检测柑橘黄龙病中的应用。

技术介绍

[0002]柑橘黄龙病(Huanglongbing，HLB)是一种危害世界柑橘产业的毁灭性的虫媒细菌性病害。黄龙病菌是一种韧皮部限制、难培养的革兰氏阴性α
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变形杆菌，根据其发现的地理分类，可分为三个亚种，分别是亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus(Las)、美洲种Candidatus Liberibacter americanus(Lam)和非洲种Candidatus Liberibacter africanus(Laf)，Las和Lam由亚洲柑橘木虱(Diaphorina citri)进行传播，而Laf是由非洲柑橘木虱(Trioza erytreae)传播，其中Las分布最为广泛，最早在亚洲报道，但已传播到非洲、中东以及整个美洲，并且由其引起的症状更严重。
[0003]先前的研究表明Las缺乏典型的III型(T3SS)分泌系统，但包含完整的Sec分泌系统(Secretory pathway)。Sec分泌系统是一种细菌内保守的途径，参与细菌蛋白的跨膜转运过程，对其生存十分重要。伴侣蛋白SecB识别具有N末端信号肽的分泌前蛋白，将其引导到内膜与SecA结合，SecA将蛋白质引导至SecYEG通道并为蛋白质易位提供能量，前蛋白通过SecYEG通道穿过内膜，信号肽被切割，转移到周质。然后通过外膜中的B桶蛋白、自转运或外膜囊泡的方式穿过外膜分泌到细胞外。目前，对黄龙病菌外泌蛋白的功能研究已经取得一些进展。
[0004]目前，HLB尚无有效的抗病基因和治疗药剂，还是通过三板斧：灭虫、无菌苗木组培脱毒、一旦发现病树及时砍除的方法来防控。早期感染的树木症状难以识别，若未能及时砍除都会成为柑橘木虱进一步传播的传染源，一片柑橘园内只要有一棵树发病，携带黄龙病菌的柑橘木虱的迁移就能够在几年内将整个果园摧毁殆尽。因此，无论是对无菌苗木的早期检测还是对病树的早期诊断，柑橘产业都急需快速可靠且灵敏性高的病原早期检测技术，以实现对柑橘黄龙病的早发现，早管理的目标，阻断黄龙病的蔓延。
[0005]目前，黄龙病病菌的检测方法主要包括田间检测、电镜检测、光谱成像检测、PCR检测和血清学方法检测等手段。由于柑橘感染黄龙病初期叶片并没有明显症状，其潜伏期从几个月到一年甚至更长时间；而且即使显症，其症状极易与其他疾病或营养缺乏引起的症状混淆，在感染初期也很难发现，因此依据症状的田间检测方法在黄龙病早期检测中具有很大的局限性。电镜检测法由于受样品采集和处理等客观因素影响，其检出率较低，一般在60％～70％，存在大量的漏检。光谱成像检测法不仅需要价格昂贵的仪器设备，还需要专业的技术人员。PCR检测因其可批量进行，能同时完成定性及定量分析已成为实验室检测黄龙病菌的常用方法，但由于菌体在植株内的分布不均，需要采集大量样本以排除假阴性，比较费时费力。近年来，血清学方法也被应用于黄龙病的检测，如柑橘黄龙病菌Serralysin蛋白多克隆抗体制备和柑橘黄龙病菌外膜蛋白多克隆抗体制备，但是其制备的抗体主要应用于HLB感染后期的样品检测，在病原早期感染的检测应用中鲜有报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能够在病原早期检测出样品是否感染黄龙病的方法。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
[0007]本专利技术提供了一种抗体在检测植物黄龙病中的应用或在制备检测植株黄龙病的试剂盒中的应用，所述抗体为SDE3蛋白抗原的特异性抗体，所述SDE3蛋白抗原为A1)或A2)的蛋白质：
[0008]A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
[0009]A2)在A1)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合标签蛋白得到的具有与A1)相同活性的可溶性融合蛋白。
[0010]进一步地，所述抗体是以所述SDE3蛋白抗原为免疫原得到的多克隆抗体。
[0011]上述应用中，所述抗体可为兔源、鼠源、马源、羊源、猪源、兔源或豚鼠源抗体。所述多克隆抗体具体可为兔多克隆抗体。
[0012]进一步地，所述植物为下述任一种
[0013]C1)双子叶植物；
[0014]C2)芸香科植物；
[0015]C3)柑橘属或柚子属植物；
[0016]C4)柑橘(柑橘属柑橘种)、广东红橙(柑橘属甜橙种)、广西砂糖桔(柑橘属)、海南三红蜜柚(柑橘属柚种)。
[0017]进一步地，所述应用中待测样品来自芸香科植物的韧皮部。
[0018]具体而言，所述待测样品具体可为植株韧皮部的汁液。
[0019]具体检测方法如下：将待检测样品的茎干及叶片主脉划开，使其中的汁液充分被尼龙膜吸收，如此反复操作每个样品点6
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8个印迹，然后将尼龙膜置于4℃冰箱中过夜，使样品充分干燥，然后将尼龙膜室温封闭2
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3h(5％脱脂奶粉溶于1
×
TBST buffer中)，再按1:10000的比例加入本专利技术制备的SDE3抗体(5％脱脂奶粉溶于1
×
TBST buffer中)室温继续孵育2
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3h，然后用1
×
TBST buffer洗尼龙膜5min，共洗3
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4次，再按1：5000的比例加入二抗AP
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conjugated goat anti
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rabbit IgG(H+L)(北京鸿跃创新科技有限公司)室温孵育1h，然后用1
×
TBST buffer洗尼龙膜5min，共洗3
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4次，信号检测按照北京索莱宝科技有限公司BCIP/NBT显色试剂盒(PR1100
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125ml)说明书操作。
[0020]进一步地，所述SDE3蛋白抗原按照包括如下步骤的方法制备，使所述SDE3蛋白抗原的编码基因在原核微生物中进行表达得到所述SDE3蛋白抗原。
[0021]进一步地，所述SDE3蛋白抗原的编码基因的编码链的编码序列是序列SEQ IDNo.1。
[0022]进一步地，使所述SDE3蛋白抗原的编码基因在原核微生物中进行表达包括将所述SDE3蛋白抗原的编码基因导入受体大肠杆菌，得到表达所述SDE3蛋白抗原的重组大肠杆菌，培养所述重组大肠杆菌，表达得到所述SDE3蛋白抗原。
[0023]进一步地，所述重组大肠杆菌为将pET
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28a
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SDE3导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的重组微生物，所述pET
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28a
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SDE3为将载体pET
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28a(+)的EcoRI和Xho本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗体在检测植物黄龙病中的应用或在制备检测植株黄龙病的试剂盒中的应用，所述抗体为SDE3蛋白抗原的特异性抗体，所述SDE3蛋白抗原为A1)或A2)的蛋白质：A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；A2)在A1)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合标签蛋白得到的具有与A1)相同活性的可溶性融合蛋白。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗体是以所述SDE3蛋白抗原为免疫原得到的多克隆抗体。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述植物为下述任一种C1)双子叶植物；C2)芸香科植物；C3)柑橘属或柚子属植物；C4)柑橘、广东红橙、广西砂糖桔、海南三红蜜柚。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用中待测样品来自芸香科植物的韧皮部。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的应用，其特征在于：所述SDE3蛋白抗原按照包括如下步骤的方法制备，使所述SDE3蛋白抗原的编码基因在原核微生物中进行表达得到所述SDE3蛋白抗原。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述SDE3蛋白抗原的编码基因的编码链的编码序列是序列SEQ ID No.1。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：使所述SDE3蛋白抗原的编码基因在原核微生物中进行表达包括将所述SDE3蛋白抗原的...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶健，孙艳伟，赵平芝，杨欢，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：