一种脱细胞气管支架的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种脱细胞气管支架的制备方法，属于生物工程技术领域；首先取新鲜气管，进行预处理；将处理好的气管转移至质量体积比为1%

【技术实现步骤摘要】
MgSO4，2mM CaCl2，2000
‑
4000U/L DNase
‑
I工作溶液中在37℃恒温摇床以60rpm转速孵育12h。
[0015]本专利技术具有以下有益效果：本专利技术脱细胞法与传统DEM法相比，整个流程时间缩短至16h以内，此外脱细胞后力学强度与原生气管无明显差异、且细胞黏附效率增加。与改良真空辅助脱细胞法相比时间也缩短一半以上，且无需特殊容器装载以及使用真空泵等大型仪器，整个脱细胞生物相容性、免疫原性也同样符合组织工程学的要求。
附图说明
[0016]图1：脱细胞气管大体观；
[0017]图2：组织学染色；
[0018]图3：DAPI荧光染色(原生与脱细胞对照)；
[0019]图4：CCK
‑
8法测细胞接种情况；
[0020]图5：脱细胞后DNA含量；
[0021]图6：气管压缩实验力学曲线；
[0022]图7：CCK
‑
8细胞黏附效果。
具体实施方式
[0023]下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不作为对本专利技术限制的依据。
[0024]实施例1：以新西兰兔来源脱细胞气管支架的制备为例：
[0025]1.脱细胞气管支架的制备
[0026]无菌手术操作获取新鲜气管为原料，经过手术器械修剪多余的筋膜、脂肪组织后，将气管浸没于提前4℃预冷的加入的三抗的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中漂洗3遍。将处理好的气管转移至40倍体积以上的1％
‑
4％(质量体积比)CHAPS溶液中在37℃恒温摇床以100rpm转速孵育3h。孵育后的气管进入无菌PBS洗涤3次，每次5min。将洗涤完毕的气管支架置于含40mM Tris
‑
HCI(pH8.0)，1.5mM MgSO4，2mM CaCl2，2000
‑
4000U/L DNase
‑
I工作溶液中在37℃恒温摇床以60rpm转速孵育12h，以溶解细胞核并降解DNA。图1可见经过脱细胞处理后的气管仍保留其原有大体形态。
[0027]2.宏观测量和生物力学测试
[0028]宏观直视下观察各组气管基质的大体形态，例如有无缺损、塌陷见图1，用力学测试机测试各组样本的抗压力学性能，采用万能试验机的固定型压盘感应器，在室温下以2mm/min的速率开始恒定压缩，记录气管的载荷/行程曲线进行比较见图6，可以得出脱细胞组与原生对照组无明显差异。
[0029]3.组织学常规染色分析
[0030]将各组样本浸于4％多聚甲醛，4℃下固定24h，石蜡包埋、切成厚度为4μm的薄片，通过光学显微镜观察切片在HE染色、Masson三色和番红O染色中的组织形态学变化。如图2所示，经过脱细胞处理，组织细胞外基质结构保持完整，且细胞核去除。
[0031]4.DAPI染色和免疫组化
[0032]DAPI与双链DNA结合，可发出较强的蓝色荧光，观察细胞核在脱细胞基质中的去除情况，如图3所示，经过脱细胞处理，组织核完全去除，未见蓝色荧光。
[0033]5.将脱细胞后的气管支架液氮冷冻研磨至粉末后，提取样本DNA测量含量，脱细胞的标准认为干重样品内的DNA含量低于50ng/mg。图5可见：脱细胞处理后均低于10ng/mg，可以达到脱细胞组织工程中的标准。
[0034]6.细胞接种试验
[0035]如图4所示，将细胞接种于0.5
×
0.5cm2的气管支架上，48h更换培养基一次，分别于第1、3、5以CCK
‑
8法测量，酶标仪测量450nm处的OD值读数，观察细胞增殖情况，可见相比原生气管组，脱细胞气管组细胞增殖情况良好，符合组织工程种子细胞种植要求。
[0036]图2、3细胞核的去除情况以及图5定量结果反应出免疫原性，满足要求。图6气管压缩实验力学曲线和图7CCK
‑
8细胞黏附效果证明脱细胞后力学强度与原生气管无明显差异；同时图7细胞黏附的CCK
‑
8实验效果反应生物相容性符合组织工程学要求。如表1：
[0037]表1：CCK
‑
8细胞黏附情况
[0038][0039]以上显示和描述了本专利技术的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本专利技术的具体实施例，本专利技术的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本专利技术的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本专利技术的专利范围之中。
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脱细胞气管支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：步骤(1)：原料取新鲜气管，进行预处理；步骤(2)：将步骤(1)中处理好的气管转移至质量体积比为1％
‑
4％的3
‑
[3
‑
(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐溶液中在37℃恒温摇床以60
‑
120rpm转速孵育1
‑
6h；步骤(3)：孵育后的气管用无菌PBS洗涤；步骤(4)：将洗涤完毕的气管置于含pH为8.0的Tris
‑
HCl缓冲液，1
‑
5mM MgSO4，1
‑
10mM CaCl2，2000
‑
4000U/L DNase
‑
I工作溶液中在37℃恒温摇床以60
‑
120rpm转速孵育6
‑
12h。2.根据权利要求1所述的脱细胞气管支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，无菌手术操作获取新西兰兔气管为原料，修剪多余筋膜、脂肪组织，之后将气管浸没于提前4℃预冷的加入的三抗的磷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：史宏灿，卢毅，卢丹，孙飞，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：