一种制备长单链DNA的方法技术

本发明专利技术适用于生物化学技术领域，提供了一种制备长单链DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：双链底物dsDNA的积累：通过PCR反应快速积累起以双链形式存在的DNA；长单链DNA的分离：将辅助短序列和双链DNA混合后进行退火处理，以移除目标长单链DNA的互补序列；长单链DNA抽提：回收凝胶分离后的长单链DNA部分；沉淀浓缩长单链DNA。该方法的辅助短序列可低成本商业化定制，无任何核酸修饰；无需使用特殊的装置或者实验操作，普适性强，可以满足常规实验室的需求；制备效率高，实际收率可达90％左右(相关方法的收率仅50

【技术实现步骤摘要】
一种制备长单链DNA的方法


[0001]本专利技术属于生物化学
，尤其涉及一种制备长单链DNA的方法。

技术介绍

[0002]长单链DNA在荧光原位杂交(FISH)、CRISPR
‑
cas9基因敲入、DNA纳米技术等领域具有重要的应用价值。目前，长单链DNA的制备方法可以根据是否借助试管内聚合酶链式扩增反应(PCR)大概分为两类。
[0003]DNA固相合成不需要借助PCR扩增，但是固相合成技术最多只能达到100
‑
120个碱基，合成效率低，成本随着序列的增长陡增，并且长序列的出错率高。生物工程法不需要在试管内进行PCR扩增，可以实现规模化制备ssDNA，但是它需要制备质粒，后续需要借助细胞机器以及提纯来完成，操作繁琐，经济性和实用性低，另外，生物工程法需要特殊的设备，无法满足常规实验室的特定需求，普适性不高。
[0004]基于试管内PCR的方法包括：固体载体捕获法、不对称PCR法、Lambda核酸外切酶法等。固体载体通常选用磁球，也是应用最多的方法，但是需要多种昂贵耗材，而且碱性变性条件会部分破坏磁球复合体及分解DNA。另外，固体载体法也可采用聚合物，但是聚合要在低氧的环境下进行，需要一定的有机合成经验，对生物实验人员有一定难度，同时该方法中引发单体聚合的自由基如果操作不当会破坏DNA底物，影响后续沉淀产物的纯度和进一步的应用(目前此方法已经有国外专利保护)。不对称PCR、Lambda核酸外切酶法均是基于PCR法直接发展而来，但是两者均对生物酶质量要求很高，高端酶价格较高。两种方法选择性差，受核酸底物局限性很大，序列越长，可行性越差，或者有些底物可能根本就不适用，即使可行，也需要严格地筛选实验条件，费时费力。Takaya在2020年新推出了一款改进的、商品化的核酸外切酶，但是仅在说明书中就存在不大适用的个例，实际使用中存在把目标单链同时降解的风险。另外，固体载体捕获法和核酸外切酶法需要特定的引物修饰，提高了成本。
[0005]目前，缺乏一种简单易行、成本低廉、普适性强、同比效率最高的长单链DNA制备方法，以满足特定的需要，弥补工业界的短板。

技术实现思路

[0006]本专利技术实施例的目的在于提供一种制备长单链DNA的方法，旨在解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0007]本专利技术实施例是这样实现的，一种制备长单链DNA的方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1、双链底物dsDNA的积累：通过PCR反应快速积累起以双链形式存在的DNA；
[0009]步骤2、长单链DNA的分离：为了移除目标长单链DNA的互补序列，将辅助短序列和双链DNA混合后进行退火处理：在600μL样品管中分别加入50ng DNA双链、与50倍浓度的辅助片段混匀后加入20mM Tris
‑
HCl缓冲溶液至总体积为30μL，将样品管置于恒温金属浴上(95℃，5min)，再置于冰上3min，然后进行琼脂糖凝胶电泳分离，电泳电压110V，缓冲液为
TAE或者TBE。
[0010]步骤3、长单链DNA抽提：回收凝胶分离后的长单链DNA部分，利用电洗脱装置对目标分子进行抽提回收，电压120
‑
180V，洗脱20
‑
40min，随后收集洗脱液，进行核酸沉淀进行浓缩(建议透析纯化后进行冻干，效果更佳)。
[0011]步骤4、沉淀浓缩长单链DNA：利用糖原或者线性聚丙烯酰胺来提高沉淀回收率，操作步骤如下：
[0012]i)向电泳洗脱液中加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.25)并混匀；
[0013]ii)加入5
‑
10μL糖原(2mg/mL)或者线性聚丙烯酰胺(5mg/mL)并混匀；
[0014]iii)加入等体积的异丙醇并混匀后，于
‑
20℃放置约2
‑
4h(或者过夜)；
[0015]iv)低温高速离心(预冷至4℃，10000
‑
13000rpm，10
‑
25min)；
[0016]v)用移液枪小心去除上清液(或者倾倒出)，加入
‑
20℃预冷的70％乙醇(500μL)，离心(10000rpm，5
‑
10min)后再次去除上清液；
[0017]vi)在室温下风干沉淀30min；
[0018]vii)向样品管中加入25μL Tris
‑
HCl缓冲液并在37℃下振动溶解，利用荧光法测定浓度，并进行电泳表征和对照。
[0019]进一步的技术方案，在所述步骤1中，PCR反应体系(25μL)为：Taq PCR预混液7.5μL(上海生物生工)，ddH2O 10μL，上、下游引物各0.5μL(100μM)，HEK263基因组模板9μL(10ng/μL)；
[0020]PCR扩增程序为预变性95℃(5min)，随后开始进入35次循环：94℃(30s)、64℃(30s)、72℃(2min)，最后72℃延伸2min，样品放入4℃保存或者立即凝胶分离和纯化。
[0021]进一步的技术方案，在所述步骤1中，PCR产物使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化，使用奥盛Nano
‑
500微量分光光度计对DNA进行定量。
[0022]进一步的技术方案，所述方法以CDR1as
‑
486、CDR1as和CDR1as
‑
201的DNA序列为模板，所述CDR1as
‑
201的序列如SEQ ID NO.1所示，所述CDR1as
‑
486的序列如SEQ ID NO.2所示，所述CDR1as的序列如SEQ ID NO.3所示(序列方向均为5
’‑3’
)。
[0023]进一步的技术方案，正向引物均为：GGTTTCCGATGGCACCTGTGT；反向引物为：
[0024]CDR1as
‑
201：TTTGCTGGAAGACTTGATTTACTGG，
[0025]CDR1as
‑
486：CCTGGATTTCTTTCTGGAAGACAC，
[0026]CDR1as：CTGGATATTGCAGACACTGGAAGAC。
[0027]进一步的技术方案，辅助短序列为：
[0028]S1：
[0029]CCTGTGTCAAGGTCTTCCAACAACTCCGGGTCTTCCAGCGACTTCAAGTC，
[0030]S2：
[0031]CTTCCAGATAATCCTGAGCTTCCAGAAAATCCACATCTTCCAGACAATCC，
[0032]S3：
[0033]CCATGTCTTCCAAGAAGCTCCAAGTCTTCCAGTAAATCAAGTCTTCCAGC，
[0034]S4：
[0035]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备长单链DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、双链底物dsDNA的积累：通过PCR反应快速积累起以双链形式存在的DNA；步骤2、长单链DNA的分离：将辅助短序列和双链DNA混合后进行退火处理，以移除目标长单链DNA的互补序列，具体的：在600μL样品管中分别加入50ng DNA双链、与50倍浓度的辅助片段，混匀后加入20mM Tris
‑
HCl缓冲溶液至总体积为30μL，将样品管置于95℃的恒温金属浴上5min，再置于冰上3min，然后进行琼脂糖凝胶电泳分离，电泳电压110V，缓冲液为TAE或者TBE；步骤3、长单链DNA抽提：回收凝胶分离后的长单链DNA部分；步骤4、沉淀浓缩长单链DNA，具体操作步骤如下：步骤4.1、向电泳洗脱液中加入1/10体积pH 5.25的3M醋酸钠并混匀；步骤4.2、加入2mg/mL的糖原5
‑
10μL，或者5mg/mL线性聚丙烯酰胺5
‑
10μL并混匀；步骤4.3、加入等体积的异丙醇并混匀后，于
‑
20℃放置2
‑
4h或者过夜；步骤4.4、预冷至4℃，10000
‑
13000rpm高速离心，10
‑
25min；步骤4.5、去除上清液，加入500μL
‑
20℃预冷的70％乙醇，10000rpm离心5
‑
10min后，再次去除上清液；步骤4.6、在室温下风干沉淀30min；步骤4.7、向样品管中加入25μL Tris
‑
HCl缓冲液并在37℃下振动溶解，利用荧光法测定浓度，并进行电泳表征和对照。2.根据权利要求1所述的制备长单链DNA的方法，其特征在于，在所述步骤1中，25μL的PCR反应体系为：Taq PCR预混液7.5μL，ddH2O 10μL，100μM的上、下游引物各0.5μL，10ng/μL的HEK263基因组模板9μL；PCR扩增程序为预变性95℃，5min，随后开始进入35次循环：94℃，30s；64℃，30s；72℃，2min；循环结束后，72℃延伸2min，样品放入4℃保存，或者立即...

【专利技术属性】
技术研发人员：李海龙，苏琳涵，周菊，蔺新丽，龚雪婷，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：