一种制备长单链DNA的方法技术

本发明专利技术适用于生物化学技术领域，提供了一种制备长单链DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：双链底物dsDNA的积累：通过PCR反应快速积累起以双链形式存在的DNA；长单链DNA的分离：将辅助短序列和双链DNA混合后进行退火处理，以移除目标长单链DNA的互补序列；长单链DNA抽提：回收凝胶分离后的长单链DNA部分；沉淀浓缩长单链DNA。该方法的辅助短序列可低成本商业化定制，无任何核酸修饰；无需使用特殊的装置或者实验操作，普适性强，可以满足常规实验室的需求；制备效率高，实际收率可达90％左右(相关方法的收率仅50

【技术实现步骤摘要】
一种制备长单链DNA的方法


[0001]本专利技术属于生物化学
，尤其涉及一种制备长单链DNA的方法。

技术介绍

[0002]长单链DNA在荧光原位杂交(FISH)、CRISPR
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cas9基因敲入、DNA纳米技术等领域具有重要的应用价值。目前，长单链DNA的制备方法可以根据是否借助试管内聚合酶链式扩增反应(PCR)大概分为两类。
[0003]DNA固相合成不需要借助PCR扩增，但是固相合成技术最多只能达到100
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120个碱基，合成效率低，成本随着序列的增长陡增，并且长序列的出错率高。生物工程法不需要在试管内进行PCR扩增，可以实现规模化制备ssDNA，但是它需要制备质粒，后续需要借助细胞机器以及提纯来完成，操作繁琐，经济性和实用性低，另外，生物工程法需要特殊的设备，无法满足常规实验室的特定需求，普适性不高。
[0004]基于试管内PCR的方法包括：固体载体捕获法、不对称PCR法、Lambda核酸外切酶法等。固体载体通常选用磁球，也是应用最多的方法，但是需要多种昂贵耗材，而且碱性变性条本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备长单链DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、双链底物dsDNA的积累：通过PCR反应快速积累起以双链形式存在的DNA；步骤2、长单链DNA的分离：将辅助短序列和双链DNA混合后进行退火处理，以移除目标长单链DNA的互补序列，具体的：在600μL样品管中分别加入50ng DNA双链、与50倍浓度的辅助片段，混匀后加入20mM Tris
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HCl缓冲溶液至总体积为30μL，将样品管置于95℃的恒温金属浴上5min，再置于冰上3min，然后进行琼脂糖凝胶电泳分离，电泳电压110V，缓冲液为TAE或者TBE；步骤3、长单链DNA抽提：回收凝胶分离后的长单链DNA部分；步骤4、沉淀浓缩长单链DNA，具体操作步骤如下：步骤4.1、向电泳洗脱液中加入1/10体积pH 5.25的3M醋酸钠并混匀；步骤4.2、加入2mg/mL的糖原5
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10μL，或者5mg/mL线性聚丙烯酰胺5
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10μL并混匀；步骤4.3、加入等体积的异丙醇并混匀后，于
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20℃放置2
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4h或者过夜；步骤4.4、预冷至4℃，10000
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13000rpm高速离心，10
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25min；步骤4.5、去除上清液，加入500μL
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20℃预冷的70％乙醇，10000rpm离心5
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10min后，再次去除上清液；步骤4.6、在室温下风干沉淀30min；步骤4.7、向样品管中加入25μL Tris
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HCl缓冲液并在37℃下振动溶解，利用荧光法测定浓度，并进行电泳表征和对照。2.根据权利要求1所述的制备长单链DNA的方法，其特征在于，在所述步骤1中，25μL的PCR反应体系为：Taq PCR预混液7.5μL，ddH2O 10μL，100μM的上、下游引物各0.5μL，10ng/μL的HEK263基因组模板9μL；PCR扩增程序为预变性95℃，5min，随后开始进入35次循环：94℃，30s；64℃，30s；72℃，2min；循环结束后，72℃延伸2min，样品放入4℃保存，或者立即...

【专利技术属性】
技术研发人员：李海龙，苏琳涵，周菊，蔺新丽，龚雪婷，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：