3-磷酸甘油酰基转移酶的突变酶及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及3

【技术实现步骤摘要】
3
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磷酸甘油酰基转移酶的突变酶及其编码基因和应用


[0001]本专利技术属于生物化学、分子生物学和代谢
，涉及3
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磷酸甘油酰基转移酶基因的核苷酸序列和相应酶蛋白的氨基酸序列的改造以及这些突变基因与酶蛋白的用途。

技术介绍

[0002]甘油脂的从头生物合成途径(de novo glycerolipid biosynthesis)是细胞中最基本的代谢过程。3
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磷酸甘油酰基转移酶(glycerol
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phosphate acyltransferase,GPAT)催化甘油脂从头合成的初始步骤，生成的溶血磷脂酸(LPA)在LPA酰基转移酶(lysophosphatidic acid acyltransferase,LPAAT)的作用下转化为磷脂酸(PA)。PA是调节真核生物中多种细胞过程的重要信号分子，也是极性甘油磷脂与中性三酰甘油(TAG)的生物合成前体。在磷酸酶的催化下PA转化为二酰甘油，后者可经脂酰辅酶A
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依赖型二酰甘油酰基转移酶(acyl
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CoA:diacylglycerol acyltransferease,DGAT)和/或磷脂
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依赖型二酰甘油酰基转移酶(phospholipid
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dependent diacylglycerol acyltransferase,PDAT)作用生成TAG。TAG合成能力是油料作物的关键性状，同时与人类肥胖症等疾病密切相关。因而，运用遗传或化学遗传方法操控TAG生物合成，继而提高油料作物含油量，但降低与肥胖症相关联的人类疾病，具有重要实践意义。
[0003]很多生化研究表明，脂酰基转移酶在TAG生物合成过程中发挥重要作用，但目前对于这类酶的结构与功能的内在关系知之甚少，参与第一步酰化反应的GPAT亦不例外，仅有少量关于其结构与功能关系的报道。已知GPAT、LPAAT、磷酸二羟丙酮酰基转移酶(dihydroxyacetone
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phosphate acyltransferase,DHAPAT)等脂酰基转移酶均含四个高度保守的结构域，结构域Ⅰ的组氨酸(H)、天冬氨酸(D)，结构域Ⅲ的甘氨酸(G)，结构域Ⅳ的脯氨酸(P)是GPAT催化所必需的；而结构域Ⅱ的精氨酸(R)与结构域Ⅲ的谷氨酸(E)在结合底物3
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磷酸甘油中起作用。迄今，对于保守结构域外的其他氨基酸残基在酰基转移酶活性调控中的作用及其与保守结构域中的氨基酸残基存在的潜在互作关系的了解非常有限。
[0004]已知植物细胞中位于内质网的GPAT9参与膜脂和TAG的生物合成，其功能缺失会导致种子发育异常、油脂合成减弱。与此一致，本实验室前期的酵母遗传互补研究显示，油菜BnGPAT9的异源表达能够恢复酵母条件致死型双敲除突变体(ZAFU1)因GPAT酶活性缺失引起的生长缺陷。然而，出乎意料，拟南芥AtGPAT9却不具备这种互补能力，尽管AtGPAT9与BnGPAT9的进化关系密切，两者氨基酸序列的一致性高达94.1％，且二者在四个酰基转移酶保守结构域的氨基酸残基完全一致。因此我们假设，保守结构域之外的某些氨基酸残基对GPAT9的活性起着重要的调节作用。

技术实现思路

[0005]针对上述问题，本研究充分利用AtGPAT9和BnGPAT9在酵母异源系统中表现出的不同性质，并结合定点突变与酵母遗传互补技术，剖析单个和多个氨基酸残基改变对GPAT9酶活性的影响，鉴定获得新的关键活性位点，以深化对脂酰基转移酶结构与功能内在关系的
认知，为酰基转移酶的分子改造与结构优化、真核生物中TAG的合成途径的改良以及全新的TAG从头合成途径的构建提供理论基础。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用的具体方案为：
[0007]第一方面，3
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磷酸甘油酰基转移酶的突变酶，是在3
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磷酸甘油酰基转移酶GPAT9的关键活性位点发生单个氨基酸残基或多个氨基酸残基的定点突变，改变GPAT9的酶活性；所述关键活性位点包括：如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的第85位、第114位、第119位、第230位、第237位、第322位。
[0008]进一步地，含有所述定点突变的氨基酸所编码的蛋白质具有比野生型3
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磷酸甘油酰基转移酶更强的酶活性；所述单个氨基酸残基的定点突变为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：(Ⅰ)与氨基酸序列如SEQ ID NO：4的野生型BnGPAT9相比，第114位氨基酸残基由苏氨酸变为亮氨酸、或第230位氨基酸残基由天冬酰胺变为天冬氨酸；(Ⅱ)与氨基酸序列如SEQ ID NO：2的野生型AtGPAT9相比，第119位氨基酸残基由天冬酰胺变为组氨酸；所述多个氨基酸残基的定点突变包括如下(1)～(11)中的任意一种：(1)与氨基酸序列如SEQ ID NO：2的野生型AtGPAT9相比，第85、119位氨基酸残基由酪氨酸、天冬酰胺分别变为色氨酸、组氨酸；(2)与氨基酸序列如SEQ ID NO：2的野生型AtGPAT9相比，第85、114、119位氨基酸残基由酪氨酸、亮氨酸、天冬酰胺分别变为色氨酸、苏氨酸、组氨酸；(3)与氨基酸序列如SEQ ID NO：2的野生型AtGPAT9相比，第85、119、237位氨基酸残基由酪氨酸、天冬酰胺、丝氨酸分别变为色氨酸、组氨酸、天冬酰胺；(4)与氨基酸序列如SEQ ID NO：2的野生型AtGPAT9相比，第85、114、119、237位氨基酸残基由酪氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、丝氨酸分别变为色氨酸、苏氨酸、组氨酸、天冬酰胺；(5)与氨基酸序列如SEQ ID NO：2的野生型AtGPAT9相比，第85、119、230位氨基酸残基由酪氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸分别变为色氨酸、组氨酸、天冬酰胺；(6)与氨基酸序列如SEQ ID NO：2的野生型AtGPAT9相比，85、119、235位氨基酸残基由酪氨酸、天冬酰胺、丙氨酸分别变为色氨酸、组氨酸、苏氨酸；(7)与氨基酸序列如SEQ ID NO：2的野生型AtGPAT9相比，第85、237位氨基酸残基由酪氨酸、丝氨酸分别变为色氨酸、天冬酰胺；(8)与氨基酸序列如SEQ ID NO：2的野生型AtGPAT9相比，第40、85、237位氨基酸残基由丝氨酸、酪氨酸、丝氨酸分别变为精氨酸、色氨酸、天冬酰胺；(9)与氨基酸序列如SEQ ID NO：2的野生型AtGPAT9相比，第119、237位氨基酸残基由天冬酰胺、丝氨酸分别变为组氨酸、天冬酰胺；(10)与氨基酸序列如SEQ ID NO：2的野生型AtGPAT9相比，第119、230、237位氨基酸残基由天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸分别变为组氨酸、天冬酰胺、天冬酰胺；(11)与氨基酸序列如SEQ ID NO：2的野生型AtGPAT9相比，第119、235、237位氨基酸残基由天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸分别变为组氨酸、苏氨酸、天冬酰胺。
[0009]第二本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.3
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磷酸甘油酰基转移酶的突变酶，其特征在于：是在3
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磷酸甘油酰基转移酶GPAT9的关键活性位点发生单个氨基酸残基或多个氨基酸残基的定点突变，GPAT9的酶活性发生改变；所述关键活性位点包括：如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的第85位、第114位、第119位、第230位、第237位、第322位。2.根据权利要求1所述的3
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磷酸甘油酰基转移酶的突变酶，其特征在于：含有所述定点突变的氨基酸所编码的蛋白质具有比野生型3
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磷酸甘油酰基转移酶更强的酶活性；所述单个氨基酸残基的定点突变为如下（Ⅰ）或（Ⅱ）：（Ⅰ）与氨基酸序列如SEQ ID NO：4的野生型BnGPAT9相比，第114位氨基酸残基由苏氨酸变为亮氨酸、或第230位氨基酸残基由天冬酰胺变为天冬氨酸；（Ⅱ）与氨基酸序列如SEQ ID NO：2的野生型AtGPAT9相比，第119位氨基酸残基由天冬酰胺变为组氨酸；所述多个氨基酸残基的定点突变为如下（1）~（11）中的任意一种：（1）与氨基酸序列如SEQ ID NO：2的野生型AtGPAT9相比，第85、119位氨基酸残基由酪氨酸、天冬酰胺分别变为色氨酸、组氨酸；（2）与氨基酸序列如SEQ ID NO：2的野生型AtGPAT9相比，第85、114、119位氨基酸残基由酪氨酸、亮氨酸、天冬酰胺分别变为色氨酸、苏氨酸、组氨酸；（3）与氨基酸序列如SEQ ID NO：2的野生型AtGPAT9相比，第85、119、237位氨基酸残基由酪氨酸、天冬酰胺、丝氨酸分别变为色氨酸、组氨酸、天冬酰胺；（4）与氨基酸序列如SEQ ID NO：2...

【专利技术属性】
技术研发人员：林怡馨，陈丹丹，刘宏波，柯星星，郑月萍，郑志富，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：