一种ATP磷酸核苷转移酶突变体及产L-组氨酸的谷氨酸棒杆菌制造技术

本发明专利技术公开了一种ATP磷酸核苷转移酶突变体及产L

【技术实现步骤摘要】
一种ATP磷酸核苷转移酶突变体及产L
‑
组氨酸的谷氨酸棒杆菌


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种ATP磷酸核苷转移酶突变体及产L
‑
组氨酸的谷氨酸棒杆菌。

技术介绍

[0002]L
‑
组氨酸(L
‑
histidine)，分子式C
18
H
32
O
15
，熔点为277℃，易溶于水(25℃水中溶解度为41.9g/L)，略微溶于醇，不溶于醚和氯仿。L
‑
组氨酸对生长、组织修复以及治疗溃疡和胃酸过多等均具有重要的作用，还可以用于治疗心脏病、过敏及风湿性关节炎和贫血等疾病。同时，L
‑
组氨酸可以与β
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丙氨酸组成肌肽，可作为治疗肾衰竭、白内障、老年性痴呆症、动脉粥样硬化等疾病的药物，还能有效地阻止其他与衰老相关的疾病以及用作膜保护型的抗溃疡药。在L
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组氨酸脱羧酶的作用下，L
‑
组氨酸可以生成组胺，组胺可以用于开发治疗失眠症和嗜睡病等多种神经系统疾病的药物。
[0003]许多研究中，将诱变与L
‑
组氨酸类似物筛选方法结合起来，选择具有结构类似物抗性或营养缺乏的突变体菌株。化学和物理诱变等不合理的设计方法可以筛选出高产的菌株，但通过这种方法得到的突变体菌株在长期培养中往往表现出不稳定的遗传性状。通过过表达组氨酸合成途径的操纵子基因，基于模型的代谢流分析等理性手段来改造谷氨酸棒杆菌虽有一定的进展，但是组氨酸的产量仍较低，难以进行工业化生产。
[0004]作为GRAS(Generally Regard as Safe)革兰氏阳性宿主，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)已被广泛用于氨基酸、有机酸和蛋白质等多种产品的生物制造且产值超千亿元。相比于大肠杆菌(Escherichia coli)和粘质沙雷菌(Serratia marcescens)等，谷氨酸棒杆菌不产生内毒素，遗传背景清晰且基因操作技术较为成熟。虽然在谷氨酸棒杆菌中有完整的L
‑
组氨酸合成途径，但是由于关键合成酶HisG会受到终产物L
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组氨酸的反馈抑制，导致野生型菌株没有L
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组氨酸的积累。此外，L
‑
组氨酸生物合成途径与几个重要的生物合成途径紧密相连，如Embden
‑
Meyerhof
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Parnas(EMP)途径、磷酸戊糖(PP)途径和嘌呤核苷酸生物合成途径。多变量模块化代谢工程(MMME)是一种强大的策略，通过过量表达限速酶，取消或敲除竞争途径中的基因，正确引导代谢通量走向感兴趣的途径。作为一种高能量消耗的氨基酸，L
‑
组氨酸是一种高能量消耗的氨基酸。根据能量消耗计算，1mol L
‑
组氨酸的生物合成需要大约9.4mol ATP。因此如何解除组氨酸的反馈抑制，强化组氨酸的代谢通量，优化细胞内ATP水平从而提高组氨酸的发酵产量是一个值得探讨的问题。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，本专利技术提供了一种ATP磷酸核苷转移酶突变体及一种高效生物合成L
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组氨酸的谷氨酸棒杆菌重组菌株，基于L
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组氨酸的Pauly反应的高通量筛选工作流程，以解除L
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组氨酸对ATP
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PRT的反馈抑制，模块化代谢工程调控组氨酸的代谢合成，合理
分配胞内资源，优化ATP的水平提高组氨酸的合成，摇瓶发酵重组菌株，组氨酸产量达到3.10g/L。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种ATP磷酸核苷转移酶突变体，该突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的ATP磷酸核苷转移酶的第56位酪氨酸突变为甲硫氨酸，且第235位苏氨酸突变为脯氨酸得到，记为HisG
T235P
‑
Y56M
。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供编码上述ATP磷酸核苷转移酶突变体的基因。
[0008]进一步地，基因序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]本专利技术的第三个目的是提供携带上述基因的载体。
[0010]本专利技术的第四个目的是提供表达上述ATP磷酸核苷转移酶突变体的细胞。
[0011]进一步地，所述细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。
[0012]本专利技术的第五个目的是提供一种产L
‑
组氨酸的谷氨酸棒杆菌，所述谷氨酸棒杆菌表达了编码上述ATP磷酸核苷转移酶突变体的基因。
[0013]进一步地，所述谷氨酸棒杆菌还过表达了编码葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶的基因zwf、编码葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶组装蛋白的基因opcA、编码6
‑
磷酸葡糖酸内酯酶的基因pgl、编码酮基转移酶的基因tkt、编码醛基转移酶的基因tal和编码肽基脯氨酰异构酶的基因prs，敲除了编码葡萄糖
‑6‑
磷酸异构酶的基因pgi、编码黄素还原酶Frd181和Frd188的基因frd1和frd2、编码AMP核苷酶的基因amn、编码氨基磷酰转移酶的基因purF。
[0014]进一步地，所述编码葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶的基因zwf的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0015]进一步地，所述编码葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶组装蛋白的基因opcA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0016]进一步地，所述编码6
‑
磷酸葡糖酸内酯酶的基因pgl的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0017]进一步地，所述酮基转移酶的基因tkt的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0018]进一步地，所述编码醛基转移酶的基因tal的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0019]进一步地，所述编码肽基脯氨酰异构酶的基因prs的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。
[0020]进一步地，所述编码葡萄糖
‑6‑
磷酸异构酶的基因pgi的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0021]进一步地，编码黄素还原酶Frd181的基因frd1的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示。
[0022]进一步地，编码黄素还原酶Frd188的基因frd2的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示。
[0023]进一步地，所述编码AMP核苷酶的基因amn的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示。
[0024]进一步地，所述编码氨基磷酰转移酶的基因purF的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示。
[0025]本专利技术的第六个目的是提供上述ATP磷酸核苷转移酶突变体或产L
‑
组氨酸的谷氨酸棒杆菌在制备L本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种ATP磷酸核苷转移酶突变体，其特征在于：所述ATP磷酸核苷转移酶突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的ATP磷酸核苷转移酶的第56位酪氨酸突变为甲硫氨酸，且第235位苏氨酸突变为脯氨酸得到。2.编码权利要求1所述的ATP磷酸核苷转移酶突变体的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.携带权利要求2所述基因的载体。5.表达权利要求1所述的ATP磷酸核苷转移酶突变体的细胞。6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于：所述细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。7.权利要求1所述的ATP磷酸核苷转移酶突变体、权利要求2或3所述的基因、权利要求4所述的载体、权利要求5或6所述的细胞在制备L
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组氨酸中的应用。8.一种产L
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组氨酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，吕雪芹，堵国成，李江华，刘延峰，柴猛，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：