一种泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶突变体及其应用，涉及生物工程领域，包括第一突变体、第二突变体或第三突变体；其氨基酸序列分别如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。公开了该突变体的编码基因、重组载体和重组菌以及其在催化丙二酰

【技术实现步骤摘要】
一种泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，尤其涉及一种泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]聚酮化合物是一类由细菌、放线菌、真菌或植物产生的次生代谢产物，其中包括大环内酯类、四环素类、蒽环类、聚醚类等，具有抗真菌、抗感染、抗肿瘤、免疫抑制等活性。聚酮化合物由聚酮合酶催化合成，可分为I型PKS、II型PKS和III型PKS。I型PKS由不同的模块组成，每个模块包括一套结构域以用来延伸或者修饰聚酮链。酰基转移酶结构域，酮基合成酶结构域和酰基载体蛋白结构域构成了三个核心结构域，每个酶结构域在生长的聚酮化合物的延伸和修饰中起不同的作用。
[0003]酰基转移酶(acyltransferase，AT)催化酰基底物形成AT
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酰基中间物并释放出辅酶A，AT
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酰基中间物将酰基转移给酰基载体蛋白(acyl carrier protein，ACP)。AT活性中心的组氨酸使催化氨基酸丝氨酸去质子化，增强丝氨酸的亲核性，促使丝氨酸攻击底物羰基碳形成AT
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酰基中间物。随后，AT
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酰基中间物亲核攻击ACP上的磷酸泛酰巯基乙胺臂上的巯基，将酰基转移到ACP上。酮基合成酶(ketosynthase，KS)结构域催化延伸单元通过克莱森缩合将聚酮链延长两个碳原子。
[0004]模块化聚酮合酶中的酰基转移酶结构域天然地对几种不同的α
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羧酰基
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CoA底物具有特异性，最常见的底物是丙二酰
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CoA和甲基丙二酰
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CoA，乙基丙二酰
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CoA稍少见一些。前人的研究表明，酰基转移酶识别不同的底物得到的最终产物会有不同的生物活性。埃博霉素聚酮合酶模块3的酰基转移酶可以同时识别和利用两种底物丙二酰
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CoA和甲基丙二酰
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CoA，生成两种不同的主要产物埃博霉素A和埃博霉素B，其中埃博霉素B的抗肿瘤活性更强。多杀菌素聚酮合酶模块8的酰基转移酶也可以识别两种底物，生成两种主要产物多杀菌素A和多杀菌素D，其中多杀菌素A的杀虫活性更强。因此，通过对聚酮合酶酰基转移酶底物特异性的改造，来获得活性更强的聚酮化合物，有重要意义。
[0005]目前，已经有一些对酰基转移酶的改造的报道。多序列比对和晶体结构研究已确定了酰基转移酶活性位点及其附近的几个关键的氨基酸残基。对重要残基的定点突变使酰基转移酶结构域保留在其天然环境中，并且对重要的蛋白质间相互作用产生最小的干扰。对酰基转移酶氨基酸序列分析后发现，距离蛋白质C端约100个氨基酸的位置是酰基转移酶活性中心，活性中心的氨基酸序列决定了酰基转移酶的底物特异性。酰基转移酶识别的底物可以通过活性中心的保守基序推断出来。识别丙二酰
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CoA的酰基转移酶活性中心通常含有基序HAFH，识别甲基丙二酰
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CoA的酰基转移酶活性中心基序则为YASH。仅改变酰基转移酶保守序列可改造底物特异性，但催化效率通常很低。现有技术尚无对泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶底物特异性进行改造。
[0006]因此，本领域的技术人员致力于开发一种对泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶的底物特异性改造和提高催化效率的突变体和应用方法。

技术实现思路

[0007]有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是开发一种对泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶的底物特异性改造和提高催化效率的突变体、重组载体和重组菌以及其应用方法。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供了一种泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶突变体，包括第一突变体、第二突变体或第三突变体；第一突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，第二突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，第三突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0009]进一步地，泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶第一突变体是将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第335位、第337位同时进行突变获得；第二突变体是将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第263位、第335位、第337位同时突变获得；第三突变体是将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第263位、第335位、第337位、第388位同时突变获得。
[0010]进一步地，如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中第335位苏氨酸突变为组氨酸、第337位甘氨酸突变为苯丙氨酸(T335H/G337F)，得到泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶第一突变体；再在泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶第一突变体两点突变的基础上将第263位色氨酸突变为甲硫氨酸(T335H/G337F/W263M)，得到泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶第二突变体；最后在泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶第二突变体三点突变的基础上将第388位甲硫氨酸突变为丙氨酸(T335H/G337F/W263M/M388A)，得到泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶第三突变体。
[0011]进一步地，基于结构和序列比对，选择活性中心的关键氨基酸进行定点突变，通过改造泰乐菌素聚酮合酶模块五的酰基转移酶结构域TylAT5，成功对底物特异性进行改造。
[0012]本专利技术还提供了一种泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶突变体的编码基因。
[0013]本专利技术还提供了泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶突变体的编码基因构建的重组载体。
[0014]进一步地，通过对泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶结构域的边界确定，从弗氏链霉菌基因组中确定了于泰乐菌素聚酮合酶模块五的酰基转移酶结构域TylAT5的基因片段范围，并构建含有基因片段的重组表达载体。
[0015]进一步地，基于序列比对，设计引物扩增出编码酰基转移酶结构域及酮基合成酶、酰基转移酶之间的连接片段的完整核酸序列，连接到表达载体上，获得了含有目的基因的表达载体，可以用于TylAT5蛋白质表达纯化。
[0016]本专利技术还提供了泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶突变体的编码基因构建的重组载体转化制备的重组菌。
[0017]本专利技术还提供了一种泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶结构域TylAT5蛋白的可溶性表达方法，包括以下步骤：
[0018]步骤1、将重组菌在LB液体培养基中，37℃摇床培养6h；转入LB液体培养基中，37℃摇床培养至OD600为0.4～0.6，加入IPTG，16℃诱导过夜；室温，离心收集菌体；
[0019]步骤2、将步骤1收集到的菌体用缓冲液重悬菌体，冰浴超声破碎，4℃10000rpm离心40min，取上清；用镍柱亲和层析纯化带有组氨酸标签的目标蛋白，上清液流穿两次，用第一咪唑缓冲液洗脱杂蛋白，用第二咪唑缓冲液洗脱目标蛋白，得到洗脱后的溶液；
[0020]步骤3、步骤2得到的洗脱后的溶液4℃离心，收集沉淀，用快速蛋白质液相色谱进一步纯化。
[0021]进一步地，步骤1中LB液体培养基含有50mg/mL卡那霉素；步骤2中加入的IPTG终浓度为0.3mM，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶突变体，其特征在于，所述泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶突变体包括第一突变体、第二突变体或第三突变体；所述第一突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述第二突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第三突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.一种如权利要求1所述的泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶突变体的编码基因。3.一种如权利要求2所述的编码基因构建的重组载体。4.一种如权利要求3所述的重组载体转化制备的重组菌。5.一种泰乐菌素聚酮合酶酰基转移酶结构域TylAT5蛋白的可溶性表达方法，其特征在于，所述可溶性表达方法包括以下步骤：步骤1、将重组菌在LB液体培养基中，37℃摇床培养6h；转入所述LB液体培养基中，37℃摇床培养至OD
600
为0.4～0.6，加入IPTG，16℃诱导过夜；室温，离心收集菌体；步骤2、将步骤1收集到的菌体用缓冲液重悬菌体，冰浴超声破碎，4℃离心40min，取上清；用镍柱亲和层析纯化带有组氨酸标签的目标蛋白，上清液流穿两次，用第一咪唑缓冲液洗脱杂蛋白，用第二咪唑缓冲液洗脱目标蛋白，得到洗脱后的溶液；步骤3、步骤2得到的洗脱后的溶液4℃离心，收集沉淀，用快速蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑舰艇，黄舒昕，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：