本发明专利技术公开了一组糖基转移酶编码基因及其应用。本发明专利技术提供的糖基转移酶UGT94M2、UGT94BE1及其衍生多肽在五环三萜类化合物底物C
【技术实现步骤摘要】
一组糖基转移酶基因及其在积雪草苷/羟基积雪草苷合成通路中的应用
[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一组糖基转移酶基因及其在积雪草苷/羟基积雪草苷合成通路中的应用。
技术介绍
[0002]积雪草，别名雷公根、马蹄草等，为伞形科植物积雪草[Centella asiatica(L.)Urb.]的干燥全草，具有清热利湿、解毒消肿的功效，在我国主要分布在长江以南的华南、华东、中南及西南地区。积雪草主要含有三萜及其苷类、多炔类、挥发油、黄酮类、生物碱等化合物，其中以三萜类的积雪草苷研究最多，被认为是积雪草发挥相关功效的主要有效成分。积雪草苷作为积雪草的主要药理活性成分之一，具有抗肿瘤、抗炎、抗纤维化、抗阿尔兹海默病、改善学习记忆能力、抗抑郁、抑制瘢痕增生和修复皮肤损伤等多种药理作用。除此之外，积雪草苷还可以抑制促炎细胞因子，促进皮肤的水合作用，促进透明质酸分泌，维持皮肤稳态，具有潜在的化妆品应用价值。另外，羟基积雪草苷也是积雪草中的有效组分之一。研究表明，羟基积雪草苷的药理学作用也非常广泛，它在临床上被用于烧伤性瘢痕、皮肤增白、抗炎抗氧化、抗抑郁症、抗肿瘤、防治冠心病等。
[0003]目前获得积雪草苷和羟基积雪草苷的主要方式是用煎煮法、回流法、超声法等从积雪草中提取，而从植物中提取存在工艺复杂、能耗高、生产周期较长等问题，且需要消耗大量的植物资源，甚至可能严重影响生态环境。此外，积雪草苷和羟基积雪草苷由于其分子结构的复杂性使得化学合成也难以实现。
[0004]合成生物学的发展为植物来源天然产物的异源合成提供了新的机遇。利用微生物如酵母等为底盘，通过代谢途径的组装和优化，在天然产物的药物合成方面具有巨大潜力。利用酵母底盘细胞通过合成生物学方法异源合成积雪草苷/羟基积雪草苷，原料廉价，发酵制备过程安全可控。因此，通过合成生物学技术制备积雪草苷，不仅具有成本优势，而且可以保证成品的品质与安全性。利用合成生物学技术制备足够量的各种高纯度积雪草苷和羟基积雪草苷单体，可用于商业用途或科学实验。
[0005]尽管积雪草苷/羟基积雪草苷在药理及化妆品方面已被证明有多种功效，但是积雪草苷/羟基积雪草苷的生物合成途径至今尚未解析。在积雪草中，目前已发现参与三萜类化合物形成的多步基因，包括法尼基焦磷酸合酶(CaFPS)、角鲨烯合酶(CaSQS)、β
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香树脂醇合酶(CaβAS)和达玛烷合成酶(CaDDS)。对三萜骨架的修饰包括通过P450单加氧酶、UDP
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Glc糖基转移酶和其他酶进行的氧化、取代或糖基化。糖基转移酶是植物糖基化过程中的关键酶，对皂苷的生物活性至关重要。积雪草苷/羟基积雪草苷由积雪草酸/羟基积雪草酸连续三步糖基化所得，目前，催化积雪草酸/羟基积雪草酸生成其单糖苷的糖基转移酶(UGT73AD1，UGT73AH1和CaUGT1)已被鉴定，但是剩余的两步糖基化步骤至今尚未解析。在本专利技术中，采用基因组与转录组相结合的筛选分析和体外酶活实验验证，鉴定了积雪草中催化积雪草酸/羟基积雪草酸单糖苷生成其双糖苷和进一步催化并生成积雪草苷/羟基积雪
草苷的关键糖基转移酶，完全解析了积雪草苷/羟基积雪草苷的生物合成途径，也为合成生物学生产积雪草苷/羟基积雪草苷奠定了理论基础。
技术实现思路
[0006]针对积雪草中尚未解析的积雪草苷/羟基积雪草苷生物合成途径，本专利技术提供了两个积雪草糖基转移酶及其编码基因，并能够催化积雪草酸单糖苷/羟基积雪草酸单糖苷最终合成积雪草苷/羟基积雪草苷。
[0007]本专利技术通过整合功能基因组学、转录组学的技术与方法，在积雪草[Centella asiatica(L.)Urban]基因组中挖掘得到2个糖基转移酶基因，分别命名为UGT94M2和UGT94BE1。分别对应SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
[0008]本专利技术还保护与SEQ ID NO：1或序列SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列所示序列的同源性≥95％，优选≥98％，如98％、99％、99.8％等的核苷酸序列。
[0009]本专利技术还保护与前述任一所述的核苷酸序列互补(较佳地完全互补)的核苷酸序列。
[0010]本专利技术还提供了上述糖基转移酶基因编码的糖基转移酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，其中：
[0011]SEQ ID NO：3的氨基酸序列由SEQ ID NO：1的核苷酸序列编码而得；
[0012]SEQ ID NO：4的氨基酸序列由SEQ ID NO：2的核苷酸序列编码而得。
[0013]在具体的实施方案中，本专利技术还保护将序列SEQ ID NO：3或序列SEQ ID NO：4添加标签序列、信号序列或分泌信号序列后形成的具有糖基转移酶活性的衍生多肽。
[0014]在具体的实施方案中，本专利技术也保护氨基酸序列与序列SEQ ID NO：3或序列SEQ ID NO：4任一条中所示氨基酸序列的同源性≥95％，并具有糖基转移酶活性的衍生多肽。
[0015]为了使序列SEQ ID NO：3或序列SEQ ID NO：4的多肽便于纯化或检测，可在前述多肽的氨基末端或羧基末端连接标签序列。
[0016]本领域普通技术人员可以很容易的采用已知的方法，对本专利技术的多肽的核苷酸序列进行突变，那些经过人工修饰的，与本专利技术的核苷酸序列具有95％以上同一性的，具有与本专利技术的多肽具有同样的功能，均属于本专利技术的衍生多肽。
[0017]本专利技术的多肽及其衍生多肽在五环三萜类化合物底物C
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28位第一个糖基上进行催化从而延伸糖链，并生成积雪草酸双糖苷、羟基积雪草酸双糖苷、积雪草苷和羟基积雪草苷的催化反应。
[0018]本专利技术还保护一种生物材料，所述生物材料为下述(C1)
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(C4)中的任一种：
[0019](C1)含有权利要求2所述的多核苷酸的表达盒；
[0020](C2)含有权利要求2所述的多核苷酸的重组载体、含有(C1)所述表达盒的重组载体；
[0021](C3)含有权利要求2所述的多核苷酸的重组微生物、含有(C1)所述表达盒的重组微生物、或含有(C2)所述重组载体的重组微生物；
[0022](C4)含有权利要求2所述的多核苷酸的遗传工程化的宿主细胞、含有(C1)所述表达盒的遗传工程化的宿主细胞、或含有(C2)所述重组载体的遗传工程化的宿主细胞。
[0023]本专利技术所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体、病毒载
体等等。在本专利技术的一个实施例中，所述载体为PSJ8载体，pGEX
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6P载体。
[0024]本专利技术还保护前文所述的多肽在催化以下一种或多种反应中的应用：
[0025](D1)催化积雪草酸单糖苷生成积雪草酸双糖苷；
[0026](D2)催化羟基积雪草酸单糖苷生成羟基积雪草酸双糖苷；
[0027](D3)催化积雪草酸双糖苷生成积雪本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种多肽，其特征在于，所述多肽为：SEQ ID NO：3或序列SEQ ID NO：4中任一条所示氨基酸序列的多肽或其衍生多肽；其中，所述衍生多肽选自：(A1)将SEQ ID NO：3或序列SEQ ID NO：4添加标签序列、信号序列或分泌信号序列后形成的具有糖基转移酶活性的衍生多肽；(A2)氨基酸序列与SEQ ID NO：3或序列SEQ ID NO：4任一条中所示氨基酸序列的同源性≥95％，并具有糖基转移酶活性的衍生多肽。2.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸选自下组：(B1)编码权利要求1所述多肽的核苷酸序列；(B2)如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的序列；(B3)与SEQ ID NO：1或序列SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列所示序列的同源性≥95％的核苷酸序列；(B4)与(B1)
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(B3)任一所述的核苷酸序列互补(较佳地完全互补)的核苷酸序列。3.生物材料，所述生物材料为下述(C1)
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(C4)中的任一种：(C1)含有权利要求2所述的多核苷酸的表达盒；(C2)含有权利要求2所述的多核苷酸的重组载体、含有(C1)所述表达盒的重组载体；(C3)含有权利要求2所述的多核苷酸的重组微生物、含有(C1)所述表达盒的重组微生物、或含有(C2)所述重组载体的重组微生物；(C4)含有权利要求2所述的多核苷酸的遗传工程化的宿主细胞、含有...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆续，李萍，杨鹏，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：
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