一种6'-唾液酸转移酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种6'

【技术实现步骤摘要】
一种6
′‑
唾液酸转移酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种6
′‑
唾液酸转移酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]在唾液酸乳糖的生产过程中，使用高浓度的底物5
’‑
胞苷三磷酸二钠盐(CTP)会显著抑制6
′‑
唾液酸转移酶Pd2,6ST(GenBank:AB012285.1)的催化效率。当底物浓度达到800mM时，该酶的转化率降低至原来的77％。因此为了进一步满足工业上大规模的生产，需要寻找一种高浓度CTP耐受性的6
′‑
唾液酸转移酶。
[0003]半理性设计方法应用于改造6
′‑
唾液酸转移酶的实例越来越多，它基于6
′‑
唾液酸转移酶蛋白质的晶体结构或同源模型，找到潜在的关键氨基酸残基位点，进行定点突变，从而改变酶的活性和稳定性等。Li Ding等人基于美人鱼发光杆菌sp.JT
‑
ISH
‑
224来源的6
′‑
唾液酸转移酶的蛋白质晶体结构，通过改变靠近受体底物结合口袋的残基而获得的突变体中，突变体A366G酶活性提高了21
‑
115％，并且表达量相比于野生型酶提高了两倍以上(Li Ding，et al.CARBOHYD RES,2015,408:127
‑
133)。这证明了该方法在6
′‑
唾液酸转移酶改造中的有效性。

技术实现思路
/>[0004]本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，基于美人鱼发光杆菌damselae的Pd2
‑
6ST基因，构建一种改造后具有高浓度底物CTP耐受性的6
′‑
唾液酸转移酶突变体。
[0005]本专利技术还要解决的技术问题是，上述6
′‑
唾液酸转移酶突变体在生产制备唾液酸乳糖中的应用和在CTP异位再生体系中的应用。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
[0007]一种6
′‑
唾液酸转移酶突变体，所述的突变体是由序列为SEQ ID NO:1的野生型6
′‑
唾液酸转移酶突变而来。
[0008]其中，所述的突变是将第449位亮氨酸突变成丙氨酸。
[0009]其中，所述的6
′‑
唾液酸转移酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0010]其中，编码上述6
′‑
唾液酸转移酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0011]一种重组载体，含有上述6
′‑
唾液酸转移酶突变体的核苷酸序列。
[0012]一种宿主细胞，含有上述重组载体或上述6
′‑
唾液酸转移酶突变体的核苷酸序列。
[0013]上述6
′‑
唾液酸转移酶突变体的构建方法，包括如下步骤：
[0014](1)构建包含所述6
′‑
唾液酸转移酶的编码基因的重组质粒，所述重组质粒以大肠杆菌为宿主；
[0015](2)以步骤(1)构建的重组质粒为模板，利用带有突变位点的寡聚核苷酸序列为引物对，通过环状PCR扩增得到包含有SEQ ID NO:5所示的碱基序列的PCR产物，之后将PCR产物采用DpnI酶消化模板，得到环状重组质粒；
[0016](3)将步骤(2)得到的环状重组质粒转化至宿主细胞BL21(DE3)感受态细胞中，获得含有6
′‑
唾液酸转移酶突变体的基因工程菌。
[0017]其中，步骤(1)中，所述的重组质粒为pET
‑
28a
‑
Pd2,6ST。
[0018]其中，步骤(2)中，所述的环状重组质粒为pET
‑
28a
‑
Pd2,6ST
‑
L449A。
[0019]上述6
′‑
唾液酸转移酶突变体在生产制备唾液酸乳糖中的应用。
[0020]结果表明，虽然随着底物CTP的终浓度从40mM提高至80mM，6
′‑
唾液酸转移酶的转化效率明显降低。但是在同一底物浓度下(40mM、80mM)比较，6
′‑
唾液酸转移酶突变体M4相比于野生型6
′‑
唾液酸转移酶WT的转化率分别高出了18.03％、26.40％。由此可见，经过改造后的6
′‑
唾液酸转移酶具有更好的底物耐受性。
[0021]上述6
′‑
唾液酸转移酶突变体在CTP异位再生体系中的应用。
[0022]结果表明，6
′‑
唾液酸转移酶突变体能够适配异位再生体系，反应可以在2L体系中，经过4
‑
5h生成40g/L左右的唾液酸乳糖。
[0023]有益效果：现有技术相比，本专利技术的6
′‑
唾液酸转移酶突变体相较于野生型的6
′‑
唾液酸转移酶具有更高的底物耐受性，可以更好的应用于唾液酸乳糖的制备上，也能够适配异位再生体系，实现CTP再生。
附图说明
[0024]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术做更进一步的具体说明，本专利技术的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
[0025]图1为重组质粒pET
‑
28a
‑
Pd2,6ST
‑
E430Y质粒图谱。
[0026]图2为重组质粒pET
‑
28a
‑
Pd2,6ST
‑
A446E质粒图谱
[0027]图3为重组质粒pET
‑
28a
‑
Pd2,6ST
‑
S447G质粒图谱
[0028]图4为重组质粒pET
‑
28a
‑
Pd2,6ST
‑
L449A质粒图谱
[0029]图5为野生6
′‑
唾液酸转移酶及其突变体的转化子的PCR验证，其中M：5000bp Marker；1：野生6
′‑
唾液酸转移酶的转化子；2：E430Y的转化子；3：A446E的转化子；4：S447G的转化子；5：L449A的转化子。
[0030]图6为CTP异位再生体系流程图。
具体实施方式
[0031]下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0032]下述实施例中，所述的DpnI酶购自于Takara；所述的pET
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28a载体、大肠杆菌宿主BL21(DE3)购自于Novagen；所述的5
’‑
胞苷三磷酸二钠购自于源叶生物。
[0033]实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种6'
‑
唾液酸转移酶突变体，其特征在于，所述的突变体是由核苷酸序列为SEQ IDNO:1的野生型6'
‑
唾液酸转移酶突变而来，其中，所述的突变是将第449位亮氨酸突变成丙氨酸。2.根据权利要求1所述的6'
‑
唾液酸转移酶突变体，其特征在于，所述的6'
‑
唾液酸转移酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。3.编码要求权利求2所述的6'
‑
唾液酸转移酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。4.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求3所述的6'
‑
唾液酸转移酶突变体的核苷酸序列。5.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求4所述的重组载体或权利要求3所述的6'
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唾液酸转移酶突变体的核苷酸序列。6.权利要求1
‑
3所述的6...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳东，王伟祎，郑诚，应汉杰，庄伟，王志，刘金乐，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：