一种UDP-糖基转移酶及其在合成黄酮糖苷衍生物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种来源于乌拉尔甘草的糖基转移酶基因UGT73AC11及其编码的蛋白。本发明专利技术通过对乌拉尔甘草基因组数据库的系统分析，从乌拉尔甘草细胞中克隆得到一种来源于UGT73AC11及其编码的蛋白，在大肠杆菌细胞中成功异源表达，并验证其催化功能，同时偶联蔗糖合酶GuSuS1和糖基转移酶UGT73AC11构建UDP循环再生系统，该系统可催化用于合成新甘草苷。本发明专利技术解决了能特异性糖基化黄酮C

【技术实现步骤摘要】
一种UDP
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糖基转移酶及其在合成黄酮糖苷衍生物中的应用

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[0001]本专利技术涉及一个来源于乌拉尔甘草的UDP
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糖基转移酶及编码基因，同时涉及一种由甘草来源的蔗糖合酶与该UDP
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糖基转移酶参与的酶法合成黄酮糖苷衍生物的方法，属于生物工程与


技术介绍
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[0002]黄酮类(flavonoid)化合物是许多药用植物的主要功能成分之一，因其具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗风湿、抗氧化等多种药理活性而在医药领域被广泛应用。但是，黄酮碳骨架结构的强疏水性极大地限制了其溶解性和生物利用度，进而限制了其工业应用价值。糖基化修饰是改善黄酮溶解性及生物利用度的强有力手段。通过在特定位点引入糖基，使其疏水部分具有更多的亲水性羧基和羟基，从而获得更有效的糖苷衍生物。近年来，许多黄酮糖苷衍生物被合成并展现出更好的生理活性，能更好地应用于药物研发。因此，以黄酮类化合物为前体开发低毒性、高药效的黄酮糖苷衍生物类药物受到广泛关注。
[0003]虽然植物可作为获得糖苷衍生物的重要来源，但由于培育周期长，糖苷衍生物含量低，提取过程繁杂，导致植物提取法难以实现糖苷衍生物高效地工业化生产，无法满足广大的市场需求。化学合成法通常因其反应步骤复杂、反应条件苛刻且涉及多种有毒有害的化学试剂，而不具备环境可持续性。同时，繁琐的羟基和羧基保护/去保护过程使得化学法难以实现区域选择性强的精准糖基化修饰。相比之下，生物合成法通常催化效率高、反应条件温和、对环境友好，而且酶的特异性催化能够将一个糖基转移到受体底物的特定位点实现区域选择性强的糖基化修饰，可见酶法是获得糖苷衍生物的重要方法。
[0004]以尿苷二磷酸
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糖(UDP
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Sugar)为糖供体将糖基转移到受体的羟基、羧基、氨基和巯基等活性位点的UDP
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糖基转移酶(UDP
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Glycosyltransferase,UGT)是各种天然产物糖基化修饰的关键酶。目前，UGT已被大量鉴定并通过酶设计成为高效的生物催化剂，用于合成具有巨大价值的糖苷衍生物。尽管已报道许多对黄酮具有糖基化活性的UGT，但大多都只能实现特定黄酮糖基化，如甘草素的糖基化修饰。目前鲜有能实现广谱性黄酮糖基化的UGT，且少有能实现黄酮C
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7OH位点糖基化修饰的UGT的报道，而黄酮C
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7OH位点修饰得到的7
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O糖苷衍生物(如新甘草苷)具有重要药理活性。因此，能特异性糖基化黄酮C
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7OH位点且具有广谱性催化的UGT缺乏是合成具有药用前景的新型黄酮糖苷衍生物的一大瓶颈。
[0005]糖基化修饰所利用的糖供体，如UDP
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葡萄糖(UDP
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glucose，UDP
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Glc)价格昂贵，不利于糖苷衍生物的规模化工业生产。针对黄酮的葡萄糖基化修饰，亟需通过构建UDP
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Glc合成途径来降低糖基化修饰的成本。蔗糖合酶能够实现以廉价蔗糖和UDP为原料的UDP
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Glc的合成，尽管目前已有大量利用蔗糖合酶和糖基转移酶实现植物天然产物低成本糖基化修饰的报道，但还未见利用蔗糖合酶实现7
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O黄酮苷低成本合成的报道。
[0006]因此，挖掘合适的UGT来实现黄酮的7
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O糖基化修饰并将其与蔗糖合酶偶联构建级联循环体系，同时实现副产物UDP的循环利用，将为黄酮糖苷衍生物的规模化工业生产提供新方向。

技术实现思路
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[0007]本专利技术的目的是挖掘并表征乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)来源的UDP
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糖基转移酶，该糖基转移酶能实现黄酮的7
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O糖基化修饰且具有广谱性，提供该糖基转移酶的基因及其编码的蛋白质，同时提供一种偶联蔗糖合酶和糖基转移酶的级联循环体系用于合成黄酮糖苷衍生物。
[0008]第一方面，本专利技术提供一种乌拉尔甘草来源的UDP
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糖基转移酶UGT73AC11，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1，所述蛋白的基因核苷酸序列SEQ ID No.2。
[0009]第二方面，本专利技术提供一种偶联糖基转移酶和蔗糖合酶的体外多酶级联体系，用于合成新甘草苷(结构如式一所示)。
[0010]附图说明:
[0011]图1为本专利技术实施例3中UGT73AC11重组蛋白表达的SDS
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PAGE图，M为蛋白标准分子量大小泳道，1为20％咪唑洗脱所得目标蛋白的泳道。
[0012]图2为本专利技术实施例5中UGT73AC11糖基供体特异性检测转化率图。
[0013]图3为本专利技术实施例5中UGT73AC11糖基受体特异性检测转化率图。
[0014]图4为本专利技术实施例5中UGT73AC11催化甘草素和UDP
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Glc反应的最适pH图。
[0015]图5为本专利技术实施例5中UGT73AC11催化甘草素和UDP
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Xyl反应的最适pH图。
[0016]图6为本专利技术实施例5中UGT73AC11催化甘草素和UDP
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Glc、UDP
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Xyl反应的最适温度图。
[0017]图7为本专利技术实施例5中UGT73AC11催化甘草素和UDP
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Glc、UDP
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Xyl反应的热稳定性图。
[0018]图8为本专利技术实施例6中UGT73AC11和GuSUS1
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Δ9偶联实现UDP
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葡萄糖循环再生的糖基修饰的反应进程图。
[0019]图9为本专利技术实施例7中甘草素葡萄糖苷的1H谱图。
[0020]图10为本专利技术实施例7中甘草素葡萄糖苷的
13
C谱图。
[0021]图11为本专利技术实施例7中甘草素木糖苷的1H谱图。
[0022]图12为本专利技术实施例7中甘草素木糖苷的
13
C谱图。
[0023]图13为本专利技术实施例7中为甘草素
‑7‑
O
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葡萄糖苷LC
‑
MS结果图。
[0024]图14为本专利技术实施例7中为异甘草素
‑7‑
O
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葡萄糖苷LC
‑
MS结果图。
[0025]图15为本专利技术实施例7中为柚皮素
‑7‑
O
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葡萄糖苷LC
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MS结果图。
[0026]图16为本专利技术实施例7中为野黄芩素
‑7‑
O
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葡萄糖苷LC
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MS结果图。
[0027]图17为本专利技术实施例7中为木犀草素
‑7‑
O
‑
葡萄糖苷LC
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种糖基转移酶UGT73AC11，其特征在于糖基转移酶UGT73AC11的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。2.如权利要求1所述的糖基转移酶，其特征在于编码糖基转移酶UGT73AC11基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯旭东，刘新菏，李春，刘护，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：