用于检测微生物的组合物和方法技术

本文描述了用于检测样品中存在或不存在微生物的组合物和方法，其包括使所述样品与能够结合所述微生物的细胞表面蛋白的适配子接触以形成复合物，使所述混合物与能够结合所述微生物的第一细胞表面蛋白或第二细胞表面蛋白的第二适配子接触；并进行测定以检测所述第二适配子，其中检测到所述第二适配子表明所述样品中存在所述微生物，并且其中未检测到所述第二适配子表明所述样品中不存在所述微生物。第二适配子表明所述样品中不存在所述微生物。

【技术实现步骤摘要】
用于检测微生物的组合物和方法
[0001]本申请是申请日为2015年2月14日的第201580008764.8号专利技术名称为“用于检测微生物的组合物和方法”的中国专利申请的分案申请。
[0002]相关申请案
[0003]本申请要求2014年2月18日提交的美国临时申请序列号61/940,955和2014年3月4日提交的美国临时申请序列号61/947,627的优先权，其各自通过引用整体并入本文。


[0004]本公开一般涉及用于检测样品中微生物存在的组合物和方法。更具体地，本公开涉及能够结合微生物蛋白的核酸适配子，以及用于以核酸适配子捕获并检测样品中微生物的方法。
[0005]通过引用将标题为“Sequence_Listing_ST25”、2015年2月13日创建的、大小16千字节的序列表整体并入本文。

技术介绍

[0006]食物和水的污染在发达国家和第三世界国家都造成了主要的健康威胁，并被认为是每年数百万人死亡和疾病的原因。另外，对食物和水的污染也威胁到动物健康，包括家畜和水生生态系统。
[0007]通常，这些疾病由微生物污染引起，例如细菌、寄生虫或病毒。就食物生产而言，复杂性和参与者的数量提供了大量的意外污染机会，以及恐怖行为和食物供应的潜在和不幸相互作用。地表和地下水通常被宠物、家畜或野生动物在水源中或附近排便污染，同时垃圾填埋场、化粪池、下水道和农田的排水也加剧了水污染。不管污染的类型和来源，个体确定食物或水是否被污染是困难的，因为它可能看起来和尝起来是好的，但仍然导致疾病和最终死亡。因此，监测食物、水、非无菌产品或环境的微生物污染在全球规模上对公众健康都是至关重要的
[0008]因此，持续需要改进的、有成本效益的以及有效监测食物和水中微生物污染的替代组合物和方法。本公开通过提供新颖适配子试剂满足此类需要，该适配子试剂对微生物上的细胞表面表位有高特异性和亲和性，用于捕获和富集以低细胞密度存在的微生物并用于直接检测(例如，通过qPCR或荧光染色)，而无需培养或细胞裂解。

技术实现思路

[0009]本公开描述了采用纯化的重组或天然蛋白，以多种修饰DNA文库通过SELEX生成针对几种金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞表面相关蛋白的慢解离速率修饰的适配子(SOMAmer)新颖试剂。获得对葡萄球菌蛋白A(SpA)、凝集因子(ClfA、ClfB)、纤连蛋白结合蛋白(FnbA、FnbB)以及铁调节的表面决定簇(Isd)具有次纳摩尔K
d
的高亲和性结合剂。几种适配子特异结合来自全部测试菌株的金黄色葡萄球菌(S.aureus)细胞，但不结合其它葡萄球菌或其它细菌。SpA和ClfA适配子证明对于从低细胞密度基质(如通过培养和PCR所
示)中选择性捕获和富集金黄色葡萄球菌细胞是有用的，得到改进的检测限和有效去除PCR抑制剂。与基因组PCR比较，当以适配子覆盖细菌细胞表面以及随后进行适配子的qPCR时，对金黄色葡萄球菌细胞的检测提高了几个数量级。
[0010]本公开描述了一种用于检测样品中存在或不存在微生物的方法，其包括：a)使该样品与第一适配子接触以形成混合物，其中该第一适配子能够结合微生物的第一细胞表面蛋白以形成复合物并且包含第一标记物，其中该第一标记物能够结合固体载体；b)使该混合物与固体载体在允许第一标记物结合固体载体的条件下接触；c)洗涤固体载体以对该混合物富集复合物和/或洗涤固体载体以基本上去除未结合物质；c)使该混合物与第二适配子接触，其中第二适配子能够结合该微生物的第一细胞表面蛋白或第二细胞表面蛋白；以及d)进行测定以检测该第二适配子，其中检测到第二适配子表明样品中存在该微生物，以及其中未检测到第二适配子表明样品中不存在该微生物。
[0011]本公开还提供了一种用于检测样品中存在或不存在微生物的方法，其包括：
[0012]a)使该样品与固体载体接触，其中第一适配子通过第一标记物结合固体载体，以及其中该第一适配子能够结合该微生物的第一细胞表面蛋白以形成复合物；b)洗涤固体载体以对该混合物富集复合物和/或洗涤固体载体以基本上去除未结合物质；c)使该混合物与第二适配子接触，其中该第二适配子能够结合该微生物的第一细胞表面蛋白或第二细胞表面蛋白并包含第二标记物；以及d)进行测定以检测第二适配子，其中检测到该第二适配子表明样品中存在该微生物，以及其中未检测到该第二适配子表明样品中不存在该微生物。.
[0013]在另一方面，第一适配子和第二适配子中的至少一个还包含至少一个C
‑
5修饰的嘧啶。在相关方面，该C
‑
5修饰的嘧啶选自5
‑
(N
‑
苄基甲酰胺)
‑
2'
‑
脱氧胞苷(BndC)；5
‑
(N
‑2‑
苯基乙基甲酰胺)
‑
2'
‑
脱氧胞苷(PEdC)；5
‑
(N
‑3‑
苯基丙基甲酰胺)
‑
2'
‑
脱氧胞苷(PPdC)；5
‑
(N
‑1‑
萘基甲基甲酰胺)
‑
2'
‑
脱氧胞苷(NapdC)；5
‑
(N
‑2‑
萘基甲基甲酰胺)
‑
2'
‑
脱氧胞苷(2NapdC)；5
‑
(N
‑1‑
萘基
‑2‑
乙基甲酰胺)
‑
2'
‑
脱氧胞苷(NEdC)；5
‑
(N
‑2‑
萘基
‑2‑
乙基甲酰胺)
‑
2'
‑
脱氧胞苷(2NEdC)；5
‑
(N
‑
苄基甲酰胺)
‑2′‑
脱氧尿苷(BndU)；5
‑
(N
‑
异丁基甲酰胺)
‑2′‑
脱氧尿苷(iBudU)；5
‑
(N
‑
色胺基甲酰胺)
‑2′‑
脱氧尿苷(TrpdU)；5
‑
(N
‑
[1
‑
(3
‑
三甲基铵)丙基]甲酰胺)
‑2′‑
脱氧尿苷氯化物以及5
‑
(N
‑
萘基甲基甲酰胺)
‑2′‑
脱氧尿苷(NapdU)。
[0014]在另一方面，第二适配子是可扩增的。在相关方面，第二适配子是酶扩增的模板(例如通过PCR或qPCR)。在再另一相关方面，第二适配子通过能够与第二适配子或第二适配子的一个或多个区域杂交的PCR引物扩增。
[0015]在另一方面，第二适配子包含第二标记物，其中第二标记物选自染料、量子点、放射标签、PCR引本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有SEQ ID NO:12序列的核酸分子，其中所述核酸分子包括多至100个核苷酸。2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中核酸分子能够以约0.03nM至约4.7nM的平衡结合常数(K
d
)结合金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞表面蛋白。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其中核酸分子能够以0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43...

【专利技术属性】
技术研发人员：U，
申请(专利权)人：私募蛋白质体运营有限公司，
类型：发明
国别省市：