猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白及其制备方法和用途、基因、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术属于生化领域，公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白，其具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。通过截取自某一野生毒株的GP5蛋白的核苷酸序列的一部分，并对截取得到的核苷酸序列进行碱基优化的实验，最终得到了一种GP5蛋白，该蛋白能够大量表达，具有较好的抗原性，在应用于试剂盒后对猪繁殖与呼吸综合征具有较优的特异性、敏感性、重复性、相关性；同时，本发明专利技术还公开了该蛋白的制备方法和用途、与该蛋白对应的基因优化位点、采用该蛋白的试剂盒和检测方法。的试剂盒和检测方法。的试剂盒和检测方法。

【技术实现步骤摘要】
猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白及其制备方法和用途、基因、试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术涉及生化领域，具体为一种猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白及其制备方法和用途、基因、试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种以感染猪发热、厌食，妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎和木乃伊胎，各种年龄猪（特别是仔猪）呼吸障碍为特征的高度传染性疾病。针对PRRSV，现有的疫苗（如灭活疫苗、弱毒疫苗等等）可以起到一定保护作用，但临床中PRRSV疫苗的滥用导致出现免疫失败。如何评价灭活疫苗和其他疫苗的免疫效果，对猪群抗体水平进行系统评价，从而合理有序地进行疫苗免疫，这对猪群的疫苗免疫具有重要参考价值。
[0003]PRRSV为单股正链的RNA病毒，因此在进化过程中不断发生变异，继而重组以及出现新的毒株，而目前有很多种手段检测PRRSV，包括RT
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PCR、荧光定量PCR、ELISA、IFA、IPMA等等。其中ELISA方法容易操作、特异性好，能检测大批量的样品，有利于对猪群PRRSV流行病学的监测和防控，是常用的血清学抗体检测方法。目前，市场上大部分的商业ELISA试剂盒使用N蛋白进行诊断，一方面是N蛋白为PRRSV抗原性最强的蛋白，可以实现早期诊断；另一方面是N蛋白为I型和Ⅱ型PRRSV的共享表位，使基于N蛋白的ELISA可以通用于两种病毒的检测。但N蛋白抗体跟保护性没有直接关系，因为它们没有病毒中和能力，无法用来评估疫苗免疫效果。而GP5蛋白又称为E蛋白，是PRRSV最重要的结构蛋白之一，且有研究表明GP5蛋白刺激机体产生抗体的中和能力明显强于M蛋白，所以临床上以选以检测GP5蛋白的抗体居多。因此，研制PRRSV血清抗体检测试剂盒的临床需求日益迫切，而检测PRRSV特异性GP5抗体水平为诊断该疾病提供了新的方法。
[0004]目前，市场上以N蛋白的IDEXX抗体检测试剂盒和检测GP5中和抗体的海博莱美洲型抗体间接试剂盒，但由于依赖国外进口，成本价格较高，采购周期较长的问题，不能快速、有效评价用于猪群自然感染病毒或接种疫苗后的免疫保护水平。
[0005]《猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定》，动物医学进展，2016,37；记载如下内容：为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体，首先构建猪GP5基因的真核重组表达载体pCDNA GP5，将其作为免疫原，对Balb/c小鼠进行免疫。取免疫４次后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。构建GP5基因的原核重组表达载体pGEX6P GP5，将其转化至大肠埃希菌Rosetta（DE3）并诱导表达。以表达的原核蛋白GP5作为单克隆抗体的筛选抗原，通过间接ELISA进行杂交瘤细胞株的检测和筛选。构建了GP5基因的真核重组表达载体pCDNA GP5，表达并纯化了GP5蛋白。经2
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3次亚克隆后获得３株针对GP5蛋白的杂交瘤细胞株，IFA和Westernblot对３株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体进行了鉴定。GP5蛋白单克隆
抗体的成功研制，为进一步建立特异性PRRSV检测方法奠定了基础。
[0006]该方案直接在毒株上通过引物扩增出蛋白核苷酸序列，并进行重组。
[0007]经过验证，如果不对原始GP5蛋白的核苷酸序列进行改造，将其制备成试剂盒，在特异性、敏感性等方面将有劣势。
[0008]所以，本案解决的技术问题是：如何通过新开发GP5蛋白以提高试剂盒的检测精度、特异性、敏感性等性能。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白，通过综合分析和选择，截取自某一野生毒株的GP5蛋白的核苷酸序列的一部分，并对截取得到的核苷酸序列进行碱基优化的实验，最终得到了一种GP5蛋白，该蛋白应用于试剂盒后对猪繁殖与呼吸综合征具有较优的特异性、敏感性、重复性、相关性。
[0010]同时，本专利技术还公开了该蛋白的制备方法和用途、与该蛋白对应的基因、采用该蛋白的试剂盒和检测方法。
[0011]本专利技术不作特殊说明的情况下：mM代表毫摩尔/升，μM代表微摩尔/升，nM代表纳摩尔/升；为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白，其具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
[0012]同时，本专利技术还公开了一种用于编码如上所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0013]SEQ ID No.1的氨基酸序列为：NSNSSSQFQLIYNLTLCELNGTDWLANKFDWAVEGGSGLAKNCMSWRYSCTRYTNFLQDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVVLDGSVATPLTRVSAEQWGRLSEQ ID No.2的核苷酸序列为：AATAGCAACAGCAGCAGCCAGTTTCAGCTGATCTACAACCTGACCCTGTGCGAACTGAACGGTACCGATTGGCTGGCGAACAAATTCGATTGGGCAGTAGAAGGCGGTTCTGGTCTGGCTAAAAACTGCATGAGCTGGCGTTACAGCTGCACCCGTTATACCAACTTCCTGCAGGATACCAAAGGTCGTCTGTATCGTTGGCGTAGTCCGGTTATCGTCGAAAAAGGCGGCAAAGTCGAGGTTGAAGGTCATCTGATCGACCTGAAACGCGTTGTTCTGGACGGTTCTGTTGCTACCCCGCTGACCCGTGTTTCTGCAGAACAGTGGGGCCGTCTGTAA。
[0014]同时本专利技术还公开了上述的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗体检测产品领域中应用。
[0015]此外，本专利技术还公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，包括预包被板，所述预包被板中被包被的蛋白为如上所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白。
[0016]在上述的检测试剂盒中，还包括样本稀释液、酶标抗体、TMB底物液、终止液、浓缩洗涤液以及封板膜、稀释板、阴性对照、阳性对照；所述的阳性对照液由样品稀释液稀释的猪阳性血清配制而成；所述的阴性对照液由样品稀释液稀释的猪阴性血清配制而成。
[0017]在上述的检测试剂盒中，所述预包被板的制备方法为：
1）抗原稀释：将猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白用包被液稀释至1μg/mL得到稀释液；2）包被标板：ELISA板的每孔加100μL稀释后浓度为1μg/mL抗原稀释液，在4
°
C的条件下放本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白，其特征在于，其具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。2.一种用于编码如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。3.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗体检测产品领域中应用。4.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括预包被板，所述预包被板中被包被的蛋白为如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白。5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括样本稀释液、酶标抗体、TMB底物液、终止液、浓缩洗涤液以及封板膜、稀释板、阴性对照、阳性对照；所述的阳性对照液由样品稀释液稀释的猪阳性血清配制而成；所述的阴性对照液由样品稀释液稀释的猪阴性血清配制而成。6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述预包被板的制备方法为：1）抗原稀释：将猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白用包被液稀释至1μg/mL得到稀释液；2）包被标板：ELISA板的每孔加100μL稀释后浓度为1μg/mL抗原稀释液，在4
°
C的条件下放置8h～12h；3）封闭：取出包被的ELISA板，用洗涤液洗涤3次，洗涤液每次加入300μL/孔，将封闭液恢复室温后，每孔加入封闭液200μL，室温封闭4h后，用PBST洗涤3次且最后一次拍干水分；4）保护：每孔加入封闭保护液200μL/孔，反应，弃液，拍干净水分；5）保存。7.一种如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：员晓庆，李雪平，曹立辉，吴育春，张小刚，
申请(专利权)人：广州悦洋生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：