牛结节性皮肤病病毒野毒株的微滴数字PCR检测引物、探针、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种牛结节性皮肤病病毒野毒株的微滴数字PCR检测引物、探针、试剂盒及其应用，本发明专利技术通过设计筛选得了用于鉴定牛结节性皮肤病病毒野毒的引物探针组，进一步的摸索了引物和探针的浓度，找到了最适的引物和探针的工作浓度，以提高ddPCR的扩增效率。本发明专利技术还提供了具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、可实现精确定量的微滴式数字化PCR试剂盒，用于牛结节性皮肤病病毒野毒的检测，可直接定量，无需标准曲线、操作简便、结果准确可靠，特别适合现场检测。对于牛结节性皮肤病病毒野毒的防控具有重大的应用价值，有助于从源头控制疫情、有效预防牛结节性皮肤病病毒的大规模爆发。

【技术实现步骤摘要】
牛结节性皮肤病病毒野毒株的微滴数字PCR检测引物、探针、试剂盒及其应用
本专利技术属于动物病毒分子生物学检测方法领域，具体涉及一种牛结节性皮肤病病毒野毒株的微滴数字PCR检测引物、探针及其应用。
技术介绍
牛结节性皮肤病(lumpyskindisease，LSD)是由痘病毒科(Poxviridae)、山羊痘病毒属(Capripoxvirus，CaPV)的牛结节性皮肤病病毒(lumpyskindiseasevirus，LSDV)引起的，以患牛发热、皮肤、黏膜、器官表面广泛性结节、淋巴结肿大、皮肤水肿为特征的传染病，世界动物卫生组织(OIE)将该病列为必须通报的疫病，我国暂对其按二类动物疫病进行管理，并采取相应防控措施。该病自然感染潜伏期2～5周，通常为7d。病牛体温升高，可达41℃以上，呈持续稽留热型。初期表现为鼻炎、结膜炎、角膜炎。感染后第4～12天体表皮肤出现硬实圆形隆起结节，直径1～5cm，触摸有痛感，尤其在头部、颈部、胸部、会阴、乳房和四肢部位明显。泌乳牛可发生乳房炎，泌乳量下降，孕牛发生流产，公牛病后不育，肉牛生产性能下降，皮张无法利用。另外，该病主要通过病畜及其畜产品的直接接触传播，也可以通过媒介生物和各种载体的携带而间接传播，且具有一定的季节性。在品种、公母和年龄大小方面无明显的易感性差别。根据这些流行病学、临床症状和病理变化特征可以进行初步诊断，但确诊需要进一步进行实验室病原学和血清学技术检测。目前，我国对LSD的诊断技术研究较少，只是在1978年采用病毒分离、电镜观察、动物接种等方法对我国首例LSDV感染病例进行了报道。在诊断方法上，我国重点对与LSDV同属的GTPV和SPPV进行了研究，己建立了检测山羊痘病毒、绵羊痘病毒P32基因的PCR方法和重组抗原的间接ELISA方法。由于山羊痘病毒属由山羊痘、绵羊痘和结节性皮肤病病毒3个种组成，其基因组保守程度高达96～97％，这为开发高特异性、高敏感性诊断检测方法带来了困难，也更加凸显了研发不同类型诊断技术方法的重要性和紧迫性。数字化PCR(DigitalPCR，dPCR)的概念早在1999年就由BertVogelstein采用并发表相关文献，其初衷是为了能够从临床样品(如尿液、淋巴液、血浆、粪便等)大量的正常体细胞中检测出微量的突变细胞，但由于当时能用于稀释样品的耗材只是384孔板，因此还不能非常好地体现数字PCR的核心理念——“无限稀释”(terminaldilution)。Bio-Rad公司的QX200系统核心的微滴化技术能够将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，本质上将传统定量PCR的一个test变成20,000个test，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度，是对“无限稀释”这一概念的完美演绎，其方法原理可称为微滴式数字化PCR(DropletDigitalPCR，ddPCR)。QX200ddPCR系统包括两台仪器：微滴发生器和微滴分析仪，及其相关的耗材。微滴发生器将每个样品分成20,000个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。随后微滴转移至96孔PCR板上，开展终点PCR扩增。采用微滴分析仪(dropletreader)逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。与传统的定量PCR相比，数字PCR的精确度和灵敏度更佳。利用微滴式数字PCR技术，研究人员可以检测稀有突变，精确测定拷贝数变异，并对基因表达进行绝对定量。凭借QX200系统的高灵敏度，研究人员如今可检测浓度低至1/1,000,000的靶分子。目前针对牛结节性皮肤病病毒野毒株尚没有理想的微滴数字PCR检测方法，因此需要提供一种牛结节性皮肤病病毒野毒株微滴数字PCR检测引物、探针及其应用以解决现有技术的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种针对牛结节性皮肤病病毒野毒株的微滴数字PCR检测引物、探针、试剂盒及应用。本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术的第一个方面，提供一种引物，所述引物用于检测牛结节性皮肤病病毒野毒株，所述引物的核苷酸序列为：LSDV-F：5’-ATTTAATTTGGGAYGATAACAACG-3’(SEQIDNO:1)；LSDV-R：5’-ACAACTCAAATCGTTAGGYGGT-3’(SEQIDNO:2)。本专利技术的第二个方面，提供一种探针，所述探针用于检测牛结节性皮肤病病毒野毒株，所述探针的核苷酸序列为：LSDV-P：5’-TATGATTTACCACCTAATGATAGTGT-3’(SEQIDNO:3)。在本专利技术的一些实施方式中，所述探针5′端标记荧光发射基团，3′端标记淬灭基团。在本专利技术的一些实施方式中，所述荧光发射基团选自FAM、HEX、TET、NED、ROX、CY5、CY3、TexasRed、TFAM、SYBRGreenI、VIC或JOE中的任一种；所淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、Dabcyl、Eclipse或NFQ-MGB中的任一种。在本专利技术的一些优选实施方式中，所述荧光发射基团为FAM；所述淬灭基团为BHQ1。本专利技术的第三个方面，提供一种检测试剂，所述检测含有本专利技术第一个方面所述的引物和/或本专利技术第二个方面所述的探针。本专利技术的第四个方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本专利技术第三个方面所述的检测试剂。在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂盒中上游引物、下游引物、探针以预混液的形式包装于所述试剂盒中。在本专利技术的一些实施方式中个，所述试剂盒中包含：预混液、微滴发生油、阴性对照、阳性对照。在本专利技术的一些实施方式中，所述预混液包括：ddPCRSupermixforprobes、上游引物、下游引物、探针。进一步地，本专利技术还提供本专利技术第一个方面所述引物或本专利技术第二个方面所述探针或本专利技术第三个方面所述检测试剂或本专利技术第四个方面所述试剂盒在检测牛结节性皮肤病病毒野毒株中的应用。本专利技术还提供一种检测牛结节性皮肤病病毒野毒株的方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)提取待测样品的DNA；(2)以步骤(1)的DNA为模板，利用本专利技术第一个方面所述引物和本专利技术第二个方面所述探针或本专利技术第三个方面所述组合物或本专利技术第四个方面所述试剂盒进行微滴数字PCR检测判定检测结果。在本专利技术的一些实施方式中，步骤(2)所述微滴数字PCR扩增的条件为：95℃预变性10min；94℃变性30sec、55～58℃退火60sec，共40个循环；98℃10min。在本专利技术的一些优选实施方式中，步骤(2)所述微滴数字PCR扩增的条件为：95℃预变性10min；94℃变性30sec、56℃退火60sec，共40个循环；98℃10min。在本专利技术的一些优选实施方式中，所述微滴数字PCR扩增的条件中升降温速度设置为2℃/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种引物，所述引物用于检测牛结节性皮肤病病毒野毒株，所述引物的核苷酸序列为：/nLSDV-F：5’-ATTTAATTTGGGAYGATAACAACG-3’(SEQ ID NO:1)；/nLSDV-R：5’-ACAACTCAAATCGTTAGGYGGT-3’(SEQ ID NO:2)。/n

【技术特征摘要】
1.一种引物，所述引物用于检测牛结节性皮肤病病毒野毒株，所述引物的核苷酸序列为：
LSDV-F：5’-ATTTAATTTGGGAYGATAACAACG-3’(SEQIDNO:1)；
LSDV-R：5’-ACAACTCAAATCGTTAGGYGGT-3’(SEQIDNO:2)。


2.一种探针，所述探针用于检测牛结节性皮肤病病毒野毒株，所述探针的核苷酸序列为：
LSDV-P：5’-TATGATTTACCACCTAATGATAGTGT-3’(SEQIDNO:3)。


3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针的5’端标记荧光发射基团，3’端标记淬灭基团；
所述荧光发射基团选自FAM、HEX、TET、NED、ROX、CY5、CY3、TexasRed、TFAM、SYBRGreenI、VIC或JOE中的任一种，优选为FAM；
所淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、Dabcyl、Eclipse或NFQ-MGB中的任一种，优选为BHQ1。


4.一种检测试剂，含有权利要求1所述的引物和/或权利要求2～3任一项所述的探针。


5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求4所述的检测试剂。


6.权利要求1所述引物或权利要求2～3任一项所述探针或权利要求4所述检测试剂或权利要求5所述试剂盒在检测牛结节性皮肤病病毒野...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹立辉，
申请(专利权)人：广州悦洋生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44