一种重离子辐照诱变疯草内生真菌诱变菌种的选育方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种重离子辐照诱变疯草内生真菌诱变菌种的选育方法，包括如下步骤：(1)以疯草内生真菌为出发菌株，培养，挑取生长良好的菌落，研磨，过滤，得到原液；(2)将步骤(1)得到的菌种原液用80MeV/u的

【技术实现步骤摘要】
一种重离子辐照诱变疯草内生真菌诱变菌种的选育方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种重离子辐照诱变疯草内生真菌(U.oxytropis)诱变菌种的选育方法。

技术介绍

[0002]疯草(locoweed)是含苦马豆素(swainsonine，SW)并可引起动物典型疯草中毒神经症状和病理学变化的棘豆属(Oxytropis)和黄芪属(Astragalus)有毒植物的统称。动物采食后会引起神经系统疾病“疯草病(Localism)”或“绵羊猝狙(Peastruck)”。早在1984年，Tulsiani D R等首次证明疯草的毒性物质主要是苦马豆素。毒理学研究表明，苦马豆素可抑制哺乳动物细胞内溶酶体α
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甘露糖苷酶和高尔基体甘露糖苷酶Ⅱ的活性，引起细胞内低聚糖代谢和糖蛋白合成障碍，导致细胞空泡变性和组织器官功能紊乱。疯草中内生真菌产生的SW是引起动物中毒病的主要原因，但同时学者发现苦马豆素在一定情况下，可作为有用的治疗药物，其中包括免疫调节剂、肿瘤转移及扩散抑制剂、抗病毒和细胞保护剂等，具有广阔生产前景。
[0003]目前，苦马豆素纯品因植物提取周期长、效率低和人工合成工艺复杂、纯化难度大等原因，导致苦马豆素价格极其昂贵，严重制约着苦马豆素作为药物的深入研究。重离子束作为一种新的辐射源，具有诱变率高、相对生物效应高、损伤修复效应小及突变不易恢复等优点。
[0004]本研究以甘肃棘豆中分离鉴定的疯草内生真菌(U.oxytropis)为研究对象，主要通过重离子辐照技术诱变疯草内生真菌(U.oxytropis)，获得稳定的高产SW疯草内生真菌及低产SW疯草内生真菌(U.oxytropis)，达到扩大SW工业化生产目的，为今后通过重离子辐照诱变技术筛选产苦马豆素的疯草内生真菌(U.oxytropis)及其次级代谢产物活性研究提供理论基础。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的就是利用重离子束辐照技术筛选出产苦马豆素含量显著提高的的疯草内生真菌(U.oxytropis)的选育方法，提供了一种操作简单、安全、成本低，产苦马豆素含量提高的疯草内生真菌(U.oxytropis)的选育方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：一种重离子辐照诱变疯草内生真菌(U.oxytropis)诱变菌种的选育方法，包括如下步骤：
[0007](1)以疯草内生真菌(Alternaria Section Undifilum oxytropis)为出发菌株，培养，挑取生长良好的菌落，研磨，过滤，得到疯草内生真菌(U.oxytropis)菌种原液；
[0008](2)将步骤(1)得到的疯草内生真菌(U.oxytropis)菌种原液用80MeV/u的
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重离子束辐照进行诱变，辐照剂量为40
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140Gy，重复两次；
[0009](3)将步骤(2)得到的诱变菌株进行接种、培养、研磨，制备成菌悬液，再次培养抽滤、漂洗、烘干并研磨破壁，收集的干粉转移至离心管中，加入甲醇提取，离心，收集上清液，
蒸干，复溶，过滤，稀释；得到诱变菌种。
[0010]优选的，步骤(1)中，菌株的培养是在25℃条件下PDA平板上培养30天。
[0011]优选的，步骤(2)中，重离子辐照使用的是重离子加速器浅层辐照端(HIRFL)提供的重离子束
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，LET为40Kev/μm。
[0012]优选的，步骤(2)中所述重离子的辐照剂量为60Gy。
[0013]优选的，步骤(3)中，培养条件为25℃恒温培养箱中培养15d，所述的再次培养条件为25℃恒温摇床中130r/min培养24d。
[0014]优选的，步骤(3)中，所述的提取方法为离心管中加入5mL的含0.8％甲酸的甲醇溶液，41℃超声提取90min，3500rpm离心5min，收集上清液。
[0015]优选的，步骤(3)中，复溶使用的是甲醇溶液。
[0016]本专利技术还提供了所述的选育方法制备得到的诱变菌种。
[0017]本专利技术还提供了所述的诱变菌种在生产苦马豆素中的应用。
[0018]本专利技术的有益效果为：本专利技术提供了一种疯草内生真菌(U.oxytropis)中苦马豆素的提取方法，通过重离子辐照诱变方法，成功筛选出与原始菌株相比产SW含量变化显著且稳定的突变菌株，其产SW平均含量为469.64μg/g，较原始菌株平均增加114.01％，相较于现有技术获得了显著的提高，且所述的方法工艺条件简单、安全，成本低、易于工业化生产，为今后通过重离子辐照诱变技术筛选产苦马豆素的疯草内生真菌(U.oxytropis)及其次级代谢产物活性研究提供理论基础，具有广阔的生产和应用前景。
附图说明
[0019]图1 12
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重离子束辐照对疯草内生真菌(U.oxytropis)菌株的致死率曲线
[0020]图2液体培养基中菌株菌丝形态注：(a)为突变体55菌丝形态，(b)为突变体63菌丝形态，(c)为突变体64菌丝形态，(d)为突变体70菌丝形态，(e)为突变体2菌丝形态，(f)为突变体61菌丝形态，(g)、(h)为原始菌株生长菌丝形态。
[0021]图3PDA培养基中菌株菌落形态注：(a)为突变株55菌落形态，(b)为突变株64菌落形态，(c)为突变株63菌落形态，(d)为突变株70菌落形态，(e)为突变株2菌落形态，(f)为重离子辐照诱变后初筛的突变株61菌落形态，(g)为突变株61传代培养后的菌落形态，(h)为原始菌株生长菌落状态。
[0022]图4 12
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重离子束辐照诱变菌株产SW含量柱状图注：C组为疯草内生真菌(U.oxytropis)原始菌株。*代表与C组相比差异显著(P＜0.05)，**代表与C组相比差异极显著(P＜0.01)。
具体实施方式
[0023]下面结合实施例对本专利技术做进一步的描述说明，但以下实例仅用来详细说明本专利技术，并不是对本专利技术范围的限制。以下实例中所涉及的仪器设备、试剂、试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0024]以下实施例中的疯草内生真菌(U.oxytropis)分离自甘肃棘豆。
[0025]实施例1、重离子辐照疯草内生真菌(U.oxytropis)菌悬液制备诱变菌种
[0026]包括如下步骤：
[0027](1)以Alternaria Section Undifilum oxytropis为出发菌株，使其在PDA平板上25℃培养30天。之后选择挑取生长良好的菌落置于菌丝研磨器中加PBS(除菌)10mL研磨，三层搽镜纸过滤除去菌丝，将过滤所得菌液移入10mL EP管中备用。
[0028](2)将菌悬液加至35mm直径的辐照盘中，每个辐照盘添加量为2mL，采用封口膜密封后置于旋转架上，利用中科院近代物理研究所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重离子辐照诱变疯草内生真菌(U.oxytropis)诱变菌种的选育方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以疯草内生真菌(Alternaria Section Undifilum oxytropis)为出发菌株，培养，挑取生长良好的菌落，研磨，过滤，得到疯草内生真菌(U.oxytropis)菌种原液；(2)将步骤(1)得到的疯草内生真菌(U.oxytropis)菌种原液用80MeV/u的
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重离子束辐照进行诱变，辐照剂量为40
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140Gy，重复两次；(3)将步骤(2)得到的诱变菌株进行接种、培养、研磨，制备成菌悬液，再次培养抽滤、漂洗、烘干并研磨破壁，收集的干粉转移至离心管中，加入甲醇提取，离心，收集上清液，蒸干，复溶，过滤，稀释；得到诱变菌种。2.如权利要求1所述的选育方法，其特征在于，步骤(1)中，菌株的培养是在25℃条件下PDA平板上培养30天。3.如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宇，杨珍，郝宝成，莫亚男，王学红，梁剑平，程富胜，张红娟，贺炯杰，崔东安，王玲，尚若锋，王胜义，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，
类型：发明
国别省市：