一种用于姜状三七检测的引物、探针及其检测方法技术

本发明专利技术涉及一种用于姜状三七检测的引物、探针及其检测方法，用于姜状三七检测的上下游引物序列如SEQ ID NO.1和2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示，探针的5

【技术实现步骤摘要】
NO.1和2所示的引物和如SEQ ID NO.3所示的探针对待测模板进行实时荧光定量PCR扩增反应；S3，待测样品中是否含有姜状三七基因组特有DNA片段的判断方法如下：依据CT值来判断待测样品中是否含有姜状三七基因组特有DNA片段，CT值小于40则判断为阳性，样品CT值大于40或无任何数值则判断为阴性。
[0009]进一步的，所述S2步骤中实时荧光定量PCR扩增的反应体系为：2xT5 Fast qPCR Mix 10μL、10uM的上游引物0.7μL、10uM的下游引物0.7μL、10uM的探针0.6μL、待测模板1μL，使用ddH2O补足至20μL反应体系。
[0010]进一步的，所述S2步骤中实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃ 1min，一个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环；在60℃退火延伸阶段采集对应荧光1min。
[0011]本专利技术还提供用于姜状三七检测的引物、探针在制备姜状三七检测试剂盒中的应用。
[0012]本专利技术的有益效果：本专利技术通过对姜状三七叶绿体基因组的序列比对分析，筛选出具有一定特异性和灵敏度的TaqMan
‑
MGB荧光探针，使探针可以特异性的检测目的基因片段的CT值，从而实现对姜状三七的快速鉴定。
附图说明
[0013]图1是本专利技术中实时荧光定量PCR的标准曲线和相关扩增曲线图；图2是本专利技术中引物探针特异性验证试验扩增曲线图；图3是本专利技术中引物探针灵敏度验证试验扩增曲线图。
具体实施方式
[0014]为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本专利技术的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
[0015]实施例一、引物对和探针的设计设计：基于姜状三七叶绿体基因组DNA，利用分子生物学软件进行引物和探针设计。
[0016]引物和探针序列如下表1所示：表1Panax zingiberensis姜状三七引物探针序列
反应体系：扩增程序：实施例二、姜状三七标准质粒的制备和探针标准曲线的创建1、申请人委托生物公司提取姜状三七的基因组DNA，根据实施例一的引物序列、反应体系和扩增程序，进行PCR扩增，获得PCR产物。
[0017]2、根据PCR产物制备阳性克隆样品，然后进行测序，选择测序结果中序列完全正确的阳性克隆样品，使用质粒提取试剂盒完成质粒的提取。
[0018]3、运用公式：C＝A
·
B
‑1×
6 .02
×
10
14
(其中A代表质粒浓度ng
·
μL
‑1，B代表质粒DNA分子量，C代表copies
·
μL
‑1)计算出质粒浓度拷贝数，获得母液浓度：姜状三七标准质粒（3.13*10
10
copies
·
μL
‑1），作为实验质粒标准品使用。
[0019]4、使用溶剂将姜状三七质粒标准品稀释至3.13*108copies
·
μL
‑1，再按10倍浓度将其稀释为5个梯度。分别以稀释过的质粒标准品为模板，在前述反应条件下进行TaqMan RT
‑
qPCR检测，每组试验重复3次，制定标准曲线。姜状三七质粒标准品检测结果如表2所示，标准曲线和相关扩增曲线如图1所示。
[0020]姜状三七标准曲线方程：y =
ꢀ‑
3.4817x + 46.089，R2=0.9999；且姜状三七标准曲线的相关系数（R2）大于0.98。
[0021]表2Panaxzingiberensis姜状三七质粒标准品检测结果实施例三、实时荧光PCR检测姜状三七样品的方法1、根据实施例一配制反应体系和设置扩增程序。
[0022]2、检测过程除了样品外，设置阳性对照、阴性对照，阳性对照为：姜状三七质粒标准品，阴性对照为：ddH2O。
[0023]3、在阳性对照、阴性对照结果均正常的情况下，依据CT值来判断待测样品中是否含有姜状三七基因组特有DNA片段，CT值小于40则判断为阳性，样品CT值大于40或无任何数值则判断为阴性。
[0024]实施例四、引物探针特异性验证验证内容：特定引物探针分别对七个近缘种进行扩增，每个样本重复3次；结果如表3所示，扩增曲线如图2所示。
[0025]验证目的：验证引物探针的特异性；表3Panax zingiberensis姜状三七引物探针特异性检测结果
结果：如上表3所示，Panaxzingiberensis姜状三七引物探针只与姜状三七种有扩增与其它种无扩增反应，特异性较好，3个重复CT值接近，重复性较好。
[0026]实施例五、引物探针灵敏度验证验证内容：对应样本DNA浓度从0.00001ng/μL、0.0001ng/μL、0.001ng/μL、0.01ng/μL、0.1ng/μL、1ng/μL，6个浓度梯度测试对应引物探针的灵敏度，每个样本重复三次，并使用实时荧光定量PCR仪进行测定；检测结果如表4和图3所示。
[0027]验证目的：验证在反应体系下Panaxzingiberensis姜状三七种引物探针的最低检测下限即灵敏度。
[0028]检测结果（灵敏度）表4：Panax zingiberensis姜状三七种引物探针灵敏度：0.001 ng/μL
如表4和图3所示，本专利技术记载的引物探针灵敏度较高。
[0029]实施例六、引物探针重复性验证分别从以下两个方面验证：1.同实验员同实时荧光定量PCR仪（QuantStudio Dx)不同批次酶之间比较；2.同批次酶同实时荧光定量PCR仪（QuantStudio Dx)不同人员操作；验证内容：每个样本重复3次，通过计算变异系数（CV%）值来进行重复性评价。计算公式：cv = sd（标准偏差）/mean（平均值）
ꢀ×
100%验证目的：验证重复性、人员操作性、不同批次聚合酶的稳定性。
[0030]表5：同实验员同QPCR仪（QuantStudioDx)不同批次酶结果表6：同批次酶同QPCR仪（QuantStudioDx)不同人员操作
结果：据表5
‑ꢀ
6所示，同实验员同实时荧光定量PCR仪（QuantStudio Dx)不同批次酶之间比较；同批次酶同实时荧光定量PCR仪（QuantStudio Dx)不同人员操作；实验结果：重复性CV%均小于3%，实验重复性好，不同批次聚合酶稳定性优良。
[0031]最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本专利技术的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本专利技术进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离本专利技术权利要求书所限定的范围。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于姜状三七检测的引物、探针，其特征在于：用于姜状三七检测的上下游引物序列如SEQ ID NO.1和2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示， 探针的5
’
端修饰ROX，3
’
端修饰MGB。2.如权利要求1所述的一种用于姜状三七检测的引物、探针的检测方法，其特征在于：包含以下步骤：S1，使用植物基因组DNA提取试剂盒提取待测样品的基因组DNA；S2，使用S1步骤提取的待测样品的基因组DNA作为待测模板，并使用如权利要求1所示的引物、探针对待测模板进行实时荧光定量PCR扩增反应；S3，待测样品中是否含有姜状三七基因组特有DNA片段的判断方法如下：依据CT值来判断待测样品中是否含有姜状三七基因组特有DNA片段，CT值小于40则...

【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，王涛，周正东，
申请(专利权)人：云南珩柯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：