一种乌拉特肋脉野豌豆实时荧光定量PCR内参基因制造技术

本发明专利技术公开了一种乌拉特肋脉野豌豆实时荧光定量PCR内参基因，该基因来源于肋脉野豌豆(Vicia costata Ledeb)实时荧光定量的内参基因，从肋脉野豌豆转录组数据中筛选多个候选内参基因，并通过实时荧光定量PCR技术检测候选内参基因在肋脉野豌豆不同营养器官以及非生物胁迫后的表达差异，利用Bestkeeper综合分析内参基因表达稳定性。Vc.EF1A和Vc.18s RNA可以作为肋脉野豌豆实时荧光定量PCR的内参基因，且在肋脉野豌豆不同器官和非生物胁迫下，内参基因能够表达稳定。内参基因能够表达稳定。内参基因能够表达稳定。

【技术实现步骤摘要】
一种乌拉特肋脉野豌豆实时荧光定量PCR内参基因


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体的涉及一种肋脉野豌豆实时荧光定量PCR内参基因。

技术介绍

[0002]肋脉野豌豆(Vicia costata Ledeb)，是豆科野豌豆属多年生牧草，因其具有抗干旱、耐瘠薄等优良特性，是野豌豆属分布在荒漠草原的唯一种，也是极其适宜在我国北方干旱草原及荒漠草原地区推广种植的品种[1]。但是由于肋脉野豌豆驯化时间较短，品种野生种性较强且种质资源稀少，严重阻碍了该品种的推广，目前对于肋脉野豌豆的研究尚浅，主要集中在生物学特性的研究，而对于肋脉野豌豆基因的研究尚未见报道。
[0003]实时荧光定量(Real Time Quantitative PCR)，属于第二代PCR技术，因其具有定量精确度高、特异性强以及灵敏度高等特点，在生命科学领域作为一种检测mRNA的方法已被广泛应用于基因的表达分析。而其中使用的理想的内参基因表达水平应不受试验条件的影响。对于豆科植物而言，在不同组织器官和生长发育阶段以及进行生物和非生物胁迫处理后的表达量评估和筛选时，使用不同的内参基因。Jian等在大豆中分析了10个常见内参基因的表达稳定性，得出在21个供试样品中EF1B和CYP2表达最稳定，且研究的这些内参基因在大豆不同器官中的表达稳定性各不相同。王蕊等以大豆不同发育时期的根、茎、叶为材料并对其进行干旱、低温、盐、脱落酸胁迫处理，分析8个候选内参基因的表达稳定性，发现在大豆的不同器官中稳定表达的内参基因不是同一个，不同胁迫处理后在各器官中稳定表达的内参也各不相同，但综合而言在大豆中最适的内参基因是ACT，全部胁迫下表达最稳定的内参基因为EF1A。综上所述，同为豆科植物，内参基因的选取并不统一，同一内参基因可以在不同组织中有不同表现，在不同处理条件下的表达也不相同，故筛选内参基因还是要做到具体问题具体分析，充分考虑生物特异性，综合分析内参基因表达的稳定性，才能找出最适合实验材料的内参基因，进而确保实时荧光PCR结果的准确性。
[0004]为了能从基因层面更好的研究肋脉野豌豆这种优质牧草的生物特性，提高实时荧光定量PCR结果的准确性，本研究筛选出在不同条件下最适合肋脉野豌豆的内参基因，为进一步挖掘其抗逆相关基因和蛋白以及其基因功能的研究奠定基础，进而为深入研究肋脉野豌豆生物特性和抗逆性提供理论依据。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的是提供一种来源于脉野豌豆的内参基因，从多个候选内参基因中分析筛选，获得稳定表达的内参基因。
[0006]本专利技术提供一种扩增肋脉野豌豆实时荧光定量PCR内参基因的引物，引物为以下序列：
[0007]Vc.EF1A F:CTGAGTGGCTTGTCTGAGG
[0008]R:GTATGAAGAGATCGTTAAGGAA
[0009]Vc.EF1B F:AAGTGGATGGTGGCAGGATA
[0010]R:GGAAGGAGTAACAACGAGAG
[0011]Vc.ACT1 F:GAGACCACATACAACTCCAT
[0012]R:GAACCACCAATCCAGACACT
[0013]Vc.ACT2 F:TGCTGTTGGTTGCCTTCTTC
[0014]R:ACTGTGATTGTCGGTCGTTC
[0015]Vc.CYP F:GTCATTACCTCTTCCTCCAT
[0016]R:CAGCCATACACTTCTTAACAG
[0017]Vc.GAPA F:AGCCTCATTCACTTCTTCAG
[0018]R:AGCAGCAGCACTTAACATAG
[0019]Vc.GAPDH F:CTCCAGTAGCAGCCATGTTA
[0020]R:AACCATACCACACCAGACAC
[0021]Vc.TUB F:GCGTCATCTCCTCCTCCAA
[0022]R:CTCTTCCATTCTCTTCGTTC
[0023]Vc.GAPB F:AATGGCTTGCTGGTAGAGGT
[0024]R:AGGTGGTTGCTTGGTATGAC
[0025]Vc.18sRNA F:CCTGCCAGTAGTCATATGCT R:TAGCTCTAGAATTACTACGGTT。
[0026]上述引物及扩增的内参基因可同时使用1个或多个，也可以进行组合使用。
[0027]本专利技术提供一种扩增肋脉野豌豆实时荧光定量PCR内参基因的引物，引物为以下序列：
[0028]Vc.EF1A：5
’‑
CTGAGTGGCTTGTCTGAGG
‑3’
；
[0029]5’‑
GTATGAAGAGATCGTTAAGGAA
‑3’
。
[0030]和Vc.18sRNA：5
’‑
CCTGCCAGTAGTCATATGCT
‑3’
；
[0031]5’‑
TAGCTCTAGAATTACTACGGTT
‑3’
。
[0032]本专利技术的一个方面，提供一种肋脉野豌豆实时荧光定量PCR内参基因，以肋脉野豌豆cDNA为模板，由上文引物扩增获得。
[0033]本专利技术的一个方面，提供一种实时定量PCR检测方法，包括使用前述的内参基因或使用前述的引物。
[0034]本专利技术的一个方面，提供上述引物或上述内参基因在肋脉野豌豆基因表达水平检测中的应用。上述应用为不同植物组织部位基因表达水平检测的应用，优选的，不同植物组织部位为根、茎和/或叶。上述应用为逆境处理后基因表达水平检测的应用，优选的，逆境处理为干旱胁迫、盐胁迫和低温胁迫处理。
[0035]特别的，本专利技术提供前述的引物或利用前述的引物扩增的内参基因在肋脉野豌豆根、茎和/或叶基因表达水平检测中的应用。
[0036]本专利技术还提供前述的引物或利用前述的引物扩增的内参基因在肋脉野豌豆干旱胁迫处理后基因表达水平检测中的应用。
[0037]本专利技术还提供前述的引物或利用前述的引物扩增的的内参基因在肋脉野豌豆盐胁迫处理和低温胁迫后基因表达水平检测中的应用。
[0038]本专利技术还提供前述的引物的退火温度，退火温度范围为51.2～59.7℃。
[0039]本专利技术还提供前述引物的PCR反应检测体系，例如20μL体系包括：0.5μL cDNA；0.5μL引物(10mM)；2μL 10
×
PCR Buffer(Mg2+free)；0.5μL TaKaRa Taq(5U/μL)；2μL dNTP Mixture(2.5mM each)；14μL ddH2O。还可以包括10
‑
500μL体系，优选为25、30、40、50、80、100μL，上述体系按照上述配比加入检测试剂。
[0040]本专利技术还提供前述引物的PCR反应程序：包括预本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种扩增肋脉野豌豆实时荧光定量PCR内参基因的引物，其特征在于，引物为以下序列：Vc.EF1A：5
’‑
CTGAGTGGCTTGTCTGAGG
‑3’
；5
’‑
GTATGAAGAGATCGTTAAGGAA
‑3’
。2.一种扩增肋脉野豌豆实时荧光定量PCR内参基因的引物，其特征在于，引物为以下序列：Vc.18sRNA：5
’‑
CCTGCCAGTAGTCATATGCT
‑3’
；5
’‑
TAGCTCTAGAATTACTACGGTT
‑3’
。3.一种肋脉野豌豆实时荧光定量PCR内参基因，其特征在于，以肋脉野豌豆cDNA为模板，权利要求1和/或权利要求2的引物扩增获得。4.一种实时定量P...

【专利技术属性】
技术研发人员：白薇，孙海莲，何馨，邱晓，林睿，王慧敏，周娜，
申请(专利权)人：内蒙古科技大学包头师范学院内蒙古自治区农牧业科学院，
类型：发明
国别省市：