一种人绒毛膜促性腺激素的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种人绒毛膜促性腺激素的纯化方法,本发明专利技术将凝胶层析和亲和层析结合，从破碎的CHO重组细胞中分离纯化出HCG纯品的方法。本发明专利技术对凝胶层析柱的滤材的制备方法进行了改进，具体为对制备羧甲基化琼脂微球的步骤进行了重新组合和调整，每一步骤都易于控制，解决了通常制备交联羧甲基化琼脂凝胶微球时，羧甲基化反应对微球机械强度和孔径影响不易控制的缺点。最后制得的羧甲基化琼脂微球保持了对人绒毛膜促性腺激素较优的特异性吸附性能，同时保持了较优的机械强度。亲和层析柱对人绒毛膜促性腺激素具有高度特异性吸附作用，该步骤可除去残留的宿主细胞或培养基的蛋白质污染物、DNA以及内毒素。DNA以及内毒素。

【技术实现步骤摘要】
一种人绒毛膜促性腺激素的纯化方法


[0001]本专利技术涉及纯化分离领域，更具体的是涉及一种人绒毛膜促性腺激素的纯化方法。

技术介绍

[0002]人绒毛膜促性腺激素(human chor i on i c gonadotrop i n，hCG)是维持人类早期妊娠的一种胎盘糖蛋白激素，在常见的恶性肿瘤中也都有表达，其异质二聚体由α和β链构成。α亚基是92个氨基酸的糖肽，其氨基酸序列与某些垂体糖蛋白激素的亚基相同，如LH、FSH、TSH。β亚基是145个氨基酸的糖肽，靠6个二硫键稳定。在13和30位Asn残基存在N
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型糖基化，C端121～145位Ser残基上有4个0
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型糖基化；糖蛋白激素β亚基具有独特的生物学活性，可促进卵泡成熟、促甲状腺及促睾丸间质细胞活性。
[0003]HCG天然产物来源有限，化学合成费用昂贵，而用基因工程技术生产HCG可望成为经济有效的新途径。同时重组人绒毛膜促性腺激素具有不含有其它促性腺激素和来源于人体的污染物的优点，特别是人体尿液中的污染物。但是，重组人绒毛膜促性腺激素的原制剂含有其重组生产中所用的细胞中的所有其它蛋白质及污染物，因此迫切需要一种能使重组绒毛膜促性腺激素完全纯化的方法。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于公开了一种将凝胶层析和亲和层析结合，从破碎的CHO重组细胞中分离纯化出HCG纯品的方法。本专利技术对凝胶层析柱的滤材的制备方法进行了改进，解决了通常制备交联羧甲基化琼脂凝胶微球时，羧甲基化反应对微球机械强度和孔径影响不易控制的缺点。最后制得的羧甲基化琼脂微球保持了对人绒毛膜促性腺激素较优的特异性吸附性能，同时保持了较优的机械强度。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：
[0006]一种人绒毛膜促性腺激素的纯化方法，包括以下步骤：
[0007]1)将异源表达的重组细胞(用CHO细胞异源表达HCG，选择高表达克隆，进行转瓶或细胞发酵罐)破碎，离心后取上层清液得到人绒毛膜促性腺激素原液；
[0008]2)将所述人绒毛膜促性腺激素原液上样至凝胶层析柱，用pH为5.5～6.5的0.1～0.15M的磷酸钠缓冲液进行洗脱，280nm分光光度计监控，收集得到人绒毛膜促性腺激素粗液。本专利技术制备的凝胶层析柱对人绒毛膜促性腺激素具有较好的特异性吸附作用，该步骤可除去绝大部分宿主细胞或培养基的蛋白质污染物和脱氧核糖核苷酸。同时该凝胶层析柱的机械性能较好，凝胶强度可达2000g/cm2以上，可适应人绒毛膜促性腺激素的高通量分离纯化；
[0009]3)将所述人绒毛膜促性腺激素粗液上样至亲和层析柱，用0.5mo l/L的NaC l洗涤液洗涤，然后用pH为8.5～9.0的含有1mo l/L NaC l的Tr i s
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HC l进行洗脱，收集得到人绒毛膜促性腺激素溶液，然后用稀盐酸调节溶液pH为7，脱盐浓缩，冷冻干燥得到人绒毛膜
促性腺激素纯品。本专利技术的亲和层析柱对人绒毛膜促性腺激素具有高度特异性吸附作用，该步骤可除去残留的宿主细胞或培养基的蛋白质污染物、DNA以及内毒素。
[0010]作为优选，所述凝胶层析柱内填充的滤材为羧甲基化交联微球，所述羧甲基化交联微球的制备方法包括以下步骤：
[0011]1)羧甲基琼脂的制备：将琼脂粉加入到乙醇溶液中，在40～60℃下溶胀0.4～0.7h，然后加入氢氧化钠碱化反应1.5～3h，所述琼脂粉与乙醇溶液的质量体积比为(4～6)g：(9～12)mL，所述乙醇溶液的浓度为70～90％，所述氢氧化钠与琼脂粉的质量比为0.08～0.15，然后再加入氯乙酸和氢氧化钠，氯乙酸、补加的氢氧化钠与琼脂粉的质量比为(1～1.3)：(0.4～0.7)：(4～6)，在50～70℃下反应4～5.5h后结束反应，冷却到室温后用冰醋酸溶液调节pH至7.0，抽真空后用乙醇洗涤沉淀物并重复多次直至滤液中无氯离子检出，将沉淀物烘干粉碎得到羧甲基化琼脂；
[0012]2)羧甲基化琼脂微球的制备：将所述羧甲基化琼脂加入水中并加热溶解，得到浓度为4～5g/mL的羧甲基化琼脂溶液，在含有EL
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40的蓖麻油中加入所述羧甲基化琼脂溶液，在95～100℃下搅拌反应0.5～1h，EL
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40在蓖麻油中的含量以体积比计为5～6％，蓖麻油与羧甲基琼脂溶液的体积比为5～7，然后用冰水浴将反应液冷却至室温并保持250～300r/mi n搅拌30～35mi n，过滤收集沉淀物并用乙醇多次洗涤，得到羧甲基化琼脂微球。在95～100℃高温环境下，羧甲基化琼脂可均匀分布在上述EL
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40和蓖麻油构建的油相中，随着体系温度快速降低和250～300r/mi n的机械搅拌下，形成的微球的粒径均匀，微球中的网格空隙均匀，微球粒径范围保持在100～200μm，比表面积保持在300～400m3/g，实验证实该粒径范围和比表面积规格的羧甲基化琼脂微球对人绒毛膜促性腺激素的特异性吸附性能明显增强；
[0013]3)羧甲基化交联微球的制备：在所述羧甲基化琼脂微球中加入乙醇溶液，然后加入1
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羟基苯并三唑，然后缓慢滴加1
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(3
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二甲胺基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺，滴加完毕后升温至60～65℃，搅拌反应6～8h，最终羧甲基化琼脂微球、1
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羟基苯并三唑以及1
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(3
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二甲胺基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺的摩尔比为：(0.8～1.2):(0.4～0.6):(1.2～1.8)，乙醇溶液是羧甲基化琼脂微球体积的10～20倍，乙醇溶液浓度为60～70％，反应完毕后过滤，收集微球并用蒸馏水洗净，用分样筛筛出150～200目的微球得到羧甲基化交联微球。本专利技术采用1
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羟基苯并三唑和1
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(3
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二甲胺基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺将羧甲基化琼脂微球进行交联，有效解决琼脂糖羧甲基化改性导致的机械强度下降的问题，实验证实，采用该方法交联得到的羧甲基化琼脂微球的机械强度较其他方法进行交联得到的交联琼脂的机械强度更优，凝胶强度可达2000g/cm2以上，可适应人绒毛膜促性腺激素的高通量分离纯化。
[0014]本专利技术对制备羧甲基化琼脂微球的步骤进行了重新组合和调整，产生了意想不到的效果，在利用氯乙酸和氢氧化钠对琼脂糖进行羧甲基化改性过程中，分步添加氢氧化钠，使得琼脂糖的羧甲基化更为均匀和可控。然后利用EL
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40和蓖麻油构成的油相将羧甲基化的琼脂制成微球，形成的微球的粒径均匀，微球中的网格空隙均匀，微球粒径范围保持在100～200μm，比表面积保持在300～400m3/g，实验证实该粒径范围和比表面积规格的羧甲基化琼脂微球对人绒毛膜促性腺激素的特异性吸附性能明显增强。最后利用1
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羟基苯并三唑和1...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人绒毛膜促性腺激素的纯化方法，其特征在于包括以下步骤：1)将异源表达的重组细胞破碎，离心后取上层清液得到人绒毛膜促性腺激素原液；2)将所述人绒毛膜促性腺激素原液上样至凝胶层析柱，用pH为5.5～6.5的0.1～0.15M的磷酸钠缓冲液进行洗脱，280nm分光光度计监控，收集得到人绒毛膜促性腺激素粗液；3)将所述人绒毛膜促性腺激素粗液上样至亲和层析柱，用0.5mol/L的NaCl洗涤液洗涤，然后用pH为8.5～9.0的含有1mol/L NaCl的Tris
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HCl进行洗脱，收集得到人绒毛膜促性腺激素溶液，然后用稀盐酸调节溶液pH为7，脱盐浓缩，冷冻干燥得到人绒毛膜促性腺激素纯品。2.根据权利要求1所述的一种人绒毛膜促性腺激素的纯化方法，其特征在于所述凝胶层析柱内填充的滤材为羧甲基化交联微球，所述羧甲基化交联微球的制备方法包括以下步骤：1)羧甲基琼脂的制备：将琼脂粉加入到乙醇溶液中，在40～60℃下溶胀0.4～0.7h，然后加入氢氧化钠碱化反应1.5～3h，所述琼脂粉与乙醇溶液的质量体积比为(4～6)g：(9～12)mL，所述乙醇溶液的浓度为70～90％，所述氢氧化钠与琼脂粉的质量比为0.08～0.15，然后再加入氯乙酸和氢氧化钠，氯乙酸、补加的氢氧化钠与琼脂粉的质量比为(1～1.3)：(0.4～0.7)：(4～6)，在50～70℃下反应4～5.5h后结束反应，冷却到室温后用冰醋酸溶液调节pH至7.0，抽真空后用乙醇洗涤沉淀物并重复多次直至滤液中无氯离子检出，将沉淀物烘干粉碎得到羧甲基化琼脂；2)羧甲基化琼脂微球的制备：将所述羧甲基化琼脂加入水中并加热溶解，得到浓度为4～5g/mL的羧甲基化琼脂溶液，在含有EL
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40的蓖麻油中加入所述羧甲基化琼脂溶液，在95～100℃下搅拌反应0.5～1h，EL
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40在蓖麻油中的含量以体积比计为5～6％，蓖麻油与羧甲基琼脂溶液的体积比为5～7，然后用冰水浴将反应液冷却至室温并保持250～300r/min搅拌30～35min，过滤收集沉淀物并用乙醇多次洗涤，得到羧甲基化琼脂微球；3)羧甲基化交联微球的制备：在所述羧甲基化琼脂微球中加入乙醇溶液，然后加入1
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羟基苯并三唑，然后缓慢滴加1
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二甲胺基丙基)
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乙基碳二亚胺，滴加完毕后升温至60～65℃，搅拌反应6～8h，最终羧甲基化琼脂微球、1
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羟基苯并三唑以及1
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(3
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二...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾京，唐维，熊心磊，王德军，李争，徐来红，李成元，
申请(专利权)人：江苏尤里卡生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：