一种改性硅胶提取尿激酶的工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，实现了从尿液中分离尿激酶的工业目标。该改性硅胶由氯化硅胶和羟基化硅胶构成。公开的改性硅胶纯化工艺不仅能将尿激酶从尿液中进行分离，还能实现HUK和LUK的初步分离，LUK粗溶液中LUK占总UK的百分比普遍高于85％，HUK粗溶液中HUK占总UK的百分比普遍高于83％。同时该方法对尿激酶的损耗极小，可以实现至少95％的回收。本发明专利技术公开的改性硅胶吸附步骤+亲和层析吸附步骤能够基本实现HUK和LUK的完全分离，可以获得纯度高达99％以上的高品质LUK纯品和HUK纯品。品和HUK纯品。

【技术实现步骤摘要】
一种改性硅胶提取尿激酶的工艺


[0001]本专利技术涉及纯化分离领域，更具体的是涉及一种改性硅胶提取尿激酶的工艺。

技术介绍

[0002]尿激酶(UK)是指从健康人尿中分离的，或从人肾组织培养中获得的一种酶蛋白，尿激酶能催化纤溶酶原生成纤溶酶。尿激酶适用于各种血栓病及心肌梗死等疾病的临床治疗。而且由于尿激酶来源于人尿或肾细胞的组织培养液，因此相比于纤维蛋白溶解酶，尿激酶具有无抗原性、无热源、毒副作用小等优点。
[0003]人尿源尿激酶主要有天然高分子量尿激酶(HUK,54000Dal)和低分子量尿激酶(LUK,33000Dal)两种。尽管体外血浆存在时，HUK和LUK的酶活性几乎相同，但HUK对原生动物体内的纤溶酶原的亲和力更高，而且在血液中的半衰期长，溶栓效果是LUK的2
‑
3倍，因此HUK的活性被认为比LUK更为重要。
[0004]正常男性一昼夜排出的尿量约在1～2L之间，尿液pH介于5.0～7.0之间，比重介于1.015～1.025之间。尿液中水分含量约95～97％，固体物质含量约3～5％，后者又可分为有机物和无机物两大类。有机物中主要是尿素，其余为肌酐、尿酸、尿色素、维生素等。无机物主要是硫酸盐、磷酸盐和钾、铵等盐类，尿激酶含量约5～7IU/mL。目前从人尿中提取尿激酶的方法主要有吸附法、超滤法、离子交换法等，但以上方法存在消耗大、酶活性回收低等问题，导致不适于大规模推广及工业化生产。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种硅胶吸附与亲和层析相结合的尿激酶纯化工艺。本专利技术公开的改性硅胶纯化工艺不仅能将尿激酶从尿液中进行分离，还能实现HUK和LUK的初步分离，LUK粗溶液中LUK占总UK的百分比普遍高于85％，HUK粗溶液中HUK占总UK的百分比普遍高于83％。同时该方法对尿激酶的损耗极小，可以实现至少95％的回收。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，包括以下步骤：
[0007]1)发泡浓缩：收集新鲜男性尿液，往尿液中通气发泡，使泡沫从上口溢出，收集泡液，在收集到的泡液中加入消泡剂，得到尿激酶原液；
[0008]2)改性硅胶吸附：平衡好改性硅胶柱后，用所述尿激酶原液上样，用第一吸附液进行过柱，吸附完成后，用第一洗脱液进行洗脱，收集不同时间的流出液并浓缩得到LUK粗溶液和HUK粗溶液；
[0009]所述改性硅胶柱中填充有氯化硅胶和羧基化硅胶；
[0010]所述第一吸附液为0.4～0.55mol/L NaCl、pH4.0～4.8的PBS缓冲液；
[0011]所述第一洗脱液为pH7.5～8.5的胺
‑
氯化铵缓冲液。
[0012]作为优选，所述氯化硅胶的制备方法包括以下步骤：将硅胶放入0.5～1.0％HF水
溶液中，反应完成后过滤，然后用水洗涤至中性，得到氟化硅胶；然后将所述氟化硅胶放入10％的盐酸中，反应完成后过滤，然后用水洗涤至中性，干燥得到氯化硅胶。
[0013]作为优选，所述羧基化硅胶的制备方法包括以下步骤：将硅胶放入乙醇溶液中，然后加入60～70％的羧酸钠乙基硅酸钠溶液，反应完成后过滤，干燥得到羧基化硅胶。
[0014]作为优选，所述氯化硅胶和所述羧基化硅胶的添加比例为(1:2)～(2:3)。
[0015]作为优选，所述氯化硅胶所选用的硅胶的比表面积为200～300m3/g，粒径范围为200～300μm。
[0016]作为优选，所述羧基化硅胶所选用的硅胶的比表面积为1000～1200m3/g，粒径范围为400～500μm。
[0017]作为优选，所述第一吸附液为0.5mol/L NaCl、pH4.5的PBS缓冲液；所述第一洗脱液为pH8.0的胺
‑
氯化铵缓冲液。
[0018]作为优选，还包括3)亲和层析吸附：将所述LUK粗溶液在亲和层析柱上进行上样，用第二吸附液进行过柱，吸附完成后，用第二洗脱液进行洗脱，收集不同时间的流出液并浓缩得到第一LUK纯溶液和第一HUK纯溶液；将所述LUK粗溶液在亲和层析柱上进行上样，用第二吸附液进行过柱，吸附完成后，用第二洗脱液进行洗脱，收集不同时间的流出液并浓缩得到第二LUK纯溶液和第二HUK纯溶液，合并所述第一LUK纯溶液和所述第二LUK纯溶液并低温干燥得到LUK纯品，合并所述第一HUK纯溶液和所述第二HUK纯溶液并低温干燥得到HUK纯品；
[0019]所述第二吸附液为：0.5mol/L NaCl和0.1mol/L AlCl3、pH4.5的0.1mol/L NaAc～HAc缓冲液；
[0020]所述第二洗脱液为：pH7.0含0.5mol/L NaCl的0.05mol/L Na2HPO4‑
NaH2PO4缓冲液。
[0021]作为优选，所述亲和层析柱的材料结构为：NH2
‑
C6H5
‑
NH
‑
CH2
‑
CH(OH)
‑
CH2
‑
O
‑
Sepharose
‑
O
‑
CH2
‑
CH(OH)
‑
CH2
‑
NH
‑
C6H5
‑
NH
‑
R其中，R＝CO
‑
CH2
‑
N(CH3)
‑
C(NH)NH2；Sepharose＝葡聚糖凝胶。
[0022]作为优选，所述葡聚糖凝胶是Sepharose 6B或Sepharose 6FF。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术公开了一种由氯化硅胶和羟基化硅胶混合制得的硅胶柱。并利用其开发了一种尿激酶的纯化工艺，实现了从尿液中分离尿激酶的工业目标。公开的改性硅胶纯化工艺不仅能将尿激酶从尿液中进行分离，还能实现HUK和LUK的初步分离，LUK粗溶液中LUK占总UK的百分比普遍高于85％，HUK粗溶液中HUK占总UK的百分比普遍高于83％。同时该方法对尿激酶的损耗极小，可以实现至少95％的回收。本专利技术公开的改性硅胶吸附步骤+亲和层析吸附步骤能够基本实现HUK和LUK的完全分离，可以获得纯度高达99％以上的高品质LUK纯品和HUK纯品。
具体实施方式
[0024]下面结合实施例，对本专利技术进一步详细说明。
[0025]实施例1：
[0026]一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，包括以下步骤：
[0027]1)发泡浓缩：收集新鲜男性尿液，往尿液中通气发泡，使泡沫从上口溢出，收集泡
液，在收集到的泡液中加入消泡剂，得到尿激酶原液；
[0028]2)改性硅胶吸附：平衡好改性硅胶柱后，用所述尿激酶原液上样，用第一吸附液进行过柱，吸附完成后，用第一洗脱液进行洗脱，收集不同时间的流出液并浓缩得到LUK粗溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，包括以下步骤：1)发泡浓缩：收集新鲜男性尿液，往尿液中通气发泡，使泡沫从上口溢出，收集泡液，在收集到的泡液中加入消泡剂，得到尿激酶原液；2)改性硅胶吸附：平衡好改性硅胶柱后，用所述尿激酶原液上样，用第一吸附液进行过柱，吸附完成后，用第一洗脱液进行洗脱，收集不同时间的流出液并浓缩得到LUK粗溶液和HUK粗溶液；所述改性硅胶柱中填充有氯化硅胶和羧基化硅胶；所述第一吸附液为0.4～0.55mol/L NaCl、pH4.0～4.8的PBS缓冲液；所述第一洗脱液为pH7.5～8.5的胺
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氯化铵缓冲液。2.根据权利要求1所述的一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，其特征在于所述氯化硅胶的制备方法包括以下步骤：将硅胶放入0.5～1.0％HF水溶液中，反应完成后过滤，然后用水洗涤至中性，得到氟化硅胶；然后将所述氟化硅胶放入10％的盐酸中，反应完成后过滤，然后用水洗涤至中性，干燥得到氯化硅胶。3.根据权利要求1所述的一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，其特征在于所述羧基化硅胶的制备方法包括以下步骤：将硅胶放入乙醇溶液中，然后加入60～70％的羧酸钠乙基硅酸钠溶液，反应完成后过滤，干燥得到羧基化硅胶。4.根据权利要求1所述的一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，其特征在于所述氯化硅胶和所述羧基化硅胶的添加比例为(1:2)～(2:3)。5.根据权利要求2所述的一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，其特征在于所述氯化硅胶所选用的硅胶的比表面积为200～300m3/g，粒径范围为200～300μm。6.根据权利要求3所述的一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，其特征在于所述羧基化硅胶所选用的硅胶的比表面积为1000～1200m3/g，粒径范围为400～500μm。7.根据权利要求1所述的一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，其特征在于所述第一吸附液为0.5mol/L NaCl、pH4.5的PBS缓冲液；所述第一洗脱液为pH8.0的胺
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氯化铵缓冲液。8.根据权利要求1所述的一种改性硅胶提取尿激酶的工艺，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾京，唐维，熊心磊，倪萌，丁晶，熊倩，郭芬，秦诗琳，金伟，杨展伟，梅双双，肖蛟龙，赵宝营，
申请(专利权)人：江苏尤里卡生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：