一种人绒毛膜促性腺激素的多步纯化工艺制造技术

本发明专利技术公开了了一种人绒毛膜促性腺激素的多步纯化工艺，发明专利技术人不仅对纯化的工艺步骤进行了优化，还对纯化所需的层析柱进行重新设计。具体地，发明专利技术人利用交联微球

【技术实现步骤摘要】
一种人绒毛膜促性腺激素的多步纯化工艺


[0001]本专利技术涉及纯化分离领域，更具体的是涉及一种人绒毛膜促性腺激素的多步纯化工艺。

技术介绍

[0002]人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)是维持人类早期妊娠的一种胎盘糖蛋白激素，在常见的恶性肿瘤中也都有表达，其异质二聚体由α和β链构成。α亚基是92个氨基酸的糖肽，其氨基酸序列与某些垂体糖蛋白激素的亚基相同，如LH、FSH、TSH。β亚基是145个氨基酸的糖肽，靠6个二硫键稳定。在13和30位Asn残基存在N
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型糖基化，C端121～145位Ser残基上有4个0
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型糖基化。HCG的药理作用主要与促黄体生成素相似，而促卵泡成熟样作用甚微，对雌性能促使卵泡成熟及排卵，并使破裂卵泡转变为黄体。促使其分泌孕激素。对雄性则具有促问质细胞激素的作用，特别是睾丸间质细胞的活动。使其产生雄激素，促使性器官和副性征发育及成熟，并促进精子生成。
[0003]目前从人尿中提取人绒毛膜促性腺激素的方法主要有吸附法、超滤法、离子交换法等，但以上方法存在消耗大、酶活性回收低等问题，导致不适于大规模推广及工业化生产。怀孕女性尿液的获取和运输存在较高的经济成本、人工成本和时间成本，同时女性尿液如不能及时进行纯化保存的话，得到的人绒毛膜促性腺激素的质量就得不到保证。因此，与从尿液中提取相比，用基因工程技术更有望成为经济有效的生产HCG的方法。重组人绒毛膜促性腺激素的原制剂含有其重组生产中所用的细胞中的所有其它蛋白质及污染物，因此迫切需要一种能使重组绒毛膜促性腺激素完全纯化的方法。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种交联微球
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凝胶吸附与亲和层析相结合的人绒毛膜促性腺激素的多步纯化工艺。纯化得到的人绒毛膜促性腺激素纯品的效价在9000U/mg左右。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种人绒毛膜促性腺激素的多步纯化工艺，包括以下步骤：
[0006]1)将异源表达的CHO重组细胞超声破碎，离心后取上层清液，用0.45μm滤器进行过滤得到人绒毛膜促性腺激素原液；
[0007]2)将所述人绒毛膜促性腺激素原液上样至交联微球
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凝胶层析柱，用pH为5.5～6.5的HCl溶液进行洗脱，280nm分光光度计监控，收集得到人绒毛膜促性腺激素粗液，所述交联
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凝胶层析柱的填料由60～70％的磺酸交联微球和30～40％的氯化硅胶构成。磺酸交联微球和氯化硅胶混合构成的交联
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凝胶层析柱具有良好的刚性和化学稳定性，粒度分布较窄且选择性曲线较陡，使得制备特性良好，同时维持了高分辨率；
[0008]3)将所述人绒毛膜促性腺激素粗液上样至亲和层析柱，用0.5mol/L的NaCl洗涤液洗涤，然后用pH为8.5～9.0的含有1mol/L NaCl的Tris
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HCl进行洗脱，收集得到人绒毛膜促
性腺激素溶液，然后用稀盐酸调节溶液pH为7，脱盐浓缩，冷冻干燥得到人绒毛膜促性腺激素纯品。
[0009]作为优选，所述磺酸交联微球的制备方法包括以下步骤：
[0010]1)在二甲基亚砜中加入甲基丙烯酸甲酯、偶氮二异丁腈、聚乙烯醇和水，混合均匀后在75～80℃反应8～12h，二甲基亚砜、甲基丙烯酸甲酯、偶氮二异丁腈、聚乙烯醇和水的体积比为(80～90)：(8～10)：(5～6)：(7～8)；
[0011]2)反应完成后继续加入2
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丙烯酰胺
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甲基丙磺酸、丙烯酸和偶氮二异丁腈，混合均匀后在75～80℃反应10～15h，2
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丙烯酰胺
‑2‑
甲基丙磺酸、丙烯酸和偶氮二异丁腈的体积比为(1～2)：(1～2)：(1～2)，反复用乙醇和水洗涤后得到磺酸交联微球。
[0012]作为优选，所述氯化硅胶的制备方法包括以下步骤：将硅胶放入0.5～1.0％HF水溶液中，反应完成后过滤，然后用水洗涤至中性，得到氟化硅胶；然后将所述氟化硅胶放入10％的盐酸中，反应完成后过滤，然后用水洗涤至中性，干燥得到氯化硅胶。
[0013]作为优选，所述亲和层析柱内填充的滤材为HCG受体亲和介质，所述HCG受体亲和介质的制备方法，包括以下步骤：将活化好的琼脂糖珠加到pH8.0～8.5的0.1～0.15M NaHCO3缓冲液中，然后加入HCG受体，琼脂糖珠、NaHCO3缓冲液和HCG受体的质量体积比为：(1～1.2)g：(1～1.2)mL：(3～4)g，所述HCG受体的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的同一性达到95％以上，在4～5℃下摇转反应8～12h，然后用pH8.0～8.5的0.1～0.15M NaHCO3缓冲液抽洗，然后用pH8.0～8.5的0.1～0.15M HCl
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甘氨酸缓冲液洗涤，干燥得到HCG受体亲和介质。
[0014]本专利技术采用的野生型人绒毛膜促性腺激素受体为NCBI参考序列：XP_016859579.1，具体氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0015]作为优选，所述NaHCO3缓冲液的pH为8.2。
[0016]作为优选，所述琼脂糖珠、NaHCO3缓冲液和HCG受体的质量体积比为：1g：1mL：3.5g。
[0017]作为优选，所述HCG受体的氨基酸序列选自以下至少一个氨基酸位点进行取代突变：108、136、271、296，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
[0018]作为优选，所述HCG受体的氨基酸序列选自以下至少一个突变或突变集进行取代突变：M108A/I271L、D136A、M108A/Y296E、Y296E，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
[0019]作为优选，所述HCG受体的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：6中的一个。
[0020]作为优选，所述HCG受体的氨基酸序列选自SEQ ID NO：6。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术公开了一种交联微球
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凝胶层析柱与亲和层析柱。并利用其开发了人绒毛膜促性腺激素的多步纯化工艺，实现了从重组CHO细胞中分离制备医药级人绒毛膜促性腺激素的工业目标。纯化得到的人绒毛膜促性腺激素纯品的效价在9000U/mg左右。
具体实施方式
[0022]下面结合实施例，对本专利技术进一步详细说明。
[0023]实施例1：
[0024]一种人绒毛膜促性腺激素的多步纯化工艺，包括以下步骤：
[0025]1)将异源表达的CHO重组细胞超声破碎，离心后取上层清液，用0.45μm滤器进行过滤得到人绒毛膜促性腺激素原液；
[0026]2)将人绒毛膜促性腺激素原液上样至交联微球
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凝胶层析柱，用p本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人绒毛膜促性腺激素的多步纯化工艺，其特征在于包括以下步骤：1)将异源表达的CHO重组细胞超声破碎，离心后取上层清液，用0.45μm滤器进行过滤得到人绒毛膜促性腺激素原液；2)将所述人绒毛膜促性腺激素原液上样至交联微球
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凝胶层析柱，用pH为5.5～6.5的HCl溶液进行洗脱，280nm分光光度计监控，收集得到人绒毛膜促性腺激素粗液，所述交联
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凝胶层析柱的填料由60～70％的磺酸交联微球和30～40％的氯化硅胶构成；3)将所述人绒毛膜促性腺激素粗液上样至亲和层析柱，用0.5mol/L的NaCl洗涤液洗涤，然后用pH为8.5～9.0的含有1mol/L NaCl的Tris
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HCl进行洗脱，收集得到人绒毛膜促性腺激素溶液，然后用稀盐酸调节溶液pH为7，脱盐浓缩，冷冻干燥得到人绒毛膜促性腺激素纯品。2.根据权利要求1所述的一种人绒毛膜促性腺激素的多步纯化工艺，其特征在于，所述磺酸交联微球的制备方法包括以下步骤：1)在二甲基亚砜中加入甲基丙烯酸甲酯、偶氮二异丁腈、聚乙烯醇和水，混合均匀后在75～80℃反应8～12h，二甲基亚砜、甲基丙烯酸甲酯、偶氮二异丁腈、聚乙烯醇和水的体积比为(80～90)：(8～10)：(5～6)：(7～8)；2)反应完成后继续加入2
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丙烯酰胺
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甲基丙磺酸、丙烯酸和偶氮二异丁腈，混合均匀后在75～80℃反应10～15h，2
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丙烯酰胺
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甲基丙磺酸、丙烯酸和偶氮二异丁腈的体积比为(1～2)：(1～2)：(1～2)，反复用乙醇和水洗涤后得到磺酸交联微球。3.根据权利要求1所述的一种人绒毛膜促性腺激素的多步纯化工艺，其特征在于，所述氯化硅胶的制备方法包括以下步骤：将硅胶放入0.5～1.0％HF水溶液中，反应完成后过滤，然后用水洗涤至中性，得到氟化硅胶；然后将所述氟化硅胶放入10％的盐酸中，反应完成后过滤，然后用水洗涤至中性，干燥得到氯化硅胶...

【专利技术属性】
技术研发人员：‑，
申请(专利权)人：江苏尤里卡生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：