一种血促性素提取纯化方法技术

本发明专利技术涉及生物制品和兽药技术领域，公开了一种血促性素提取纯化方法，步骤为：1）采用偏磷酸调节孕马血清的pH为4.5～5.0，进行固液分离，收集上清液；2）采用第一沉淀剂对上清液进行沉淀处理，收集滤液；3）采用第二沉淀剂对滤液进行沉淀处理，收集沉淀物，沉淀物经干燥处理，得到血促性素粗品；4）将血促性素粗品溶解依次进行第一超滤、亲和层析、第二超滤、阳离子交换层析处理，得到血促性素粗品过滤液；采用第三沉淀剂对血促性素粗品过滤液进行沉淀处理，收集沉淀物，沉淀物经干燥得到血促性素纯品。本发明专利技术提取纯化方法制备的血促性素纯度能够达到99.9%以上，总收率能够达到88.9%，效价能够达到11000 IU/mg。IU/mg。

【技术实现步骤摘要】
一种血促性素提取纯化方法


[0001]本专利技术涉及生物制品和兽药
，具体涉及一种血促性素提取纯化方法。

技术介绍

[0002]血促性素为孕马血清或血浆中提取的血清促性腺激素，是来自于妊娠40～120天怀孕母马血清(浆)加工纯化制品，具备用于繁殖中促卵泡素及黄体生成素的双重性质；对于雌性动物，可促进其卵巢中卵泡发育及黄体生成；对于雄性动物，可促进睾丸精细管中精子生成及睾丸间质细胞分泌。试验证明，PMSG在同期发情、超数排卵、胚胎移植、治疗不发情、弱发情、情期不孕等方面应用效果极佳。1992年，我国农业部首次将兽用血促性素纳入《中国兽药规范》(1992年版)中，至2011年又收至我国农业部药典中。
[0003]随着血促性素应用范围的扩大和规模化养殖的普及，导致市场对血促性素的需求量大幅上升。目前，孕马血清促性腺激素的提取纯化的方法主要有偏磷酸分离
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盐析
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乙醇沉淀
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透析法、偏磷酸分离
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离子交换法和硫酸铵盐析
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透析法等。但现有的血促性素提取纯化方法生产工艺繁琐，劳动强度大，生产成本高，血促性素收率低；而且，制备的血促性素的纯度低、效价低，使用效果差。因此，亟需提供一种血促性素的高效纯化提取方法。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中存在的问题和不足，本专利技术的目的旨在提供一种血促性素提取纯化方法。
[0005]为实现专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0006]一种血促性素提取纯化方法，包括以下步骤：
[0007](1)采用偏磷酸调节孕马血清的pH为4.5～5.0，然后进行固液分离，收集上清液；
[0008](2)采用第一沉淀剂对所述上清液进行沉淀处理，固液分离，收集滤液；
[0009](3)采用第二沉淀剂对所述滤液进行沉淀处理，固液分离，收集沉淀物，沉淀物经干燥处理，得到血促性素粗品；
[0010](4)将血促性素粗品溶解，得到血促性素粗品溶液；将血促性素粗品溶液依次进行第一超滤、亲和层析、第二超滤、阳离子交换层析处理，得到血促性素粗品过滤液；采用第三沉淀剂对血促性素粗品过滤液进行沉淀处理，收集沉淀物，沉淀物经干燥处理，得到血促性素纯品。
[0011]优选地，所述亲和层析中亲和层析柱的层析基质为Blue Sepharose 6Fast Flow。
[0012]优选地，亲和层析过程中上样后先采用洗涤液冲洗亲和层析柱，然后采用洗脱缓冲液进行洗脱；所述亲和层析采用的洗涤液为氯化钠和磷酸二氢钠的混合水溶液，洗涤液的电导率为10～15ms/cm，洗涤液中磷酸二氢钠的浓度为0.05mol/L，氯化钠的浓度为0.07mol/L。亲和层析采用的洗脱缓冲液为氯化钠溶液，氯化钠溶液的电导率为40～50ms/cm，氯化钠溶液的浓度为0.45mol/。更加优选地，所述亲和层析采用的洗涤液的pH为6.0～7.0；所述亲和层析采用的洗脱缓冲液的pH为6.0～7.0。
[0013]优选地，所述阳离子交换层析中阳离子交换层析柱的层析基质为SP
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Sepharose Fast Flow。
[0014]优选地，阳离子交换层析过程中上样后先采用洗涤液冲洗阳离子交换层析柱，然后采用洗脱缓冲液进行洗脱。所述阳离子交换层析采用的洗涤液为氯化钠和醋酸钠的混合水溶液，洗涤液的电导率为10～15ms/cm，洗涤液中醋酸钠的浓度为0.01mol/L，氯化钠的浓度为0.13mol/L。阳离子交换层析采用的洗脱缓冲液为氯化钠和和醋酸钠的混合水溶液，洗脱缓冲液的电导率为30～40ms/cm，洗脱缓冲液中醋酸钠的浓度为0.01mol/L，氯化钠的浓度为0.35mol/L。更加优选地，所述阳离子交换层析采用的洗涤液的pH为4.0～5.0；所述阳离子交换层析采用的洗脱缓冲液的pH为7.0～8.0。
[0015]优选地，所述第一超滤采用的滤膜的截留分子量为10KDa，第一超滤处理后血促性素粗品溶液的电导率为10～15ms/cm。
[0016]优选地，所述第二超滤采用的滤膜的截留分子量为10KDa，第二超滤处理后血促性素粗品溶液的电导率为7～10ms/cm。
[0017]优选地，亲和层析处理前，将第一超滤处理后的血促性素粗品溶液pH调节至6.0～7.0；阳离子交换层析处理前，将第二超滤处理后的血促性素粗品溶液pH调节至4.0～5.0。
[0018]优选地，所述第一沉淀剂为乙醇和硅藻土；采用第一沉淀剂对所述上清液进行沉淀处理的操作为：向所述上清液中加入乙醇至上清液中的乙醇体积分数为55％～60％，然后再加入硅藻土，边加边搅拌。更加优选地，第一沉淀剂中所述乙醇为无水乙醇；所述硅藻土的用量为孕马血清总重的0.3％～0.5％。
[0019]优选地，所述第二沉淀剂、第三沉淀剂均为乙醇。更加优选地，所述第二沉淀剂、第三沉淀剂均为无水乙醇。
[0020]优选地，采用第二沉淀剂对所述滤液进行沉淀处理的操作为：向所述滤液中加入无水乙醇至滤液中的乙醇体积分数为70％～80％，边加边搅拌。
[0021]优选地，采用第三沉淀剂对所述血促性素粗品过滤液进行沉淀处理的操作为：向所述血促性素粗品过滤液中加入无水乙醇至血促性素粗品过滤液中的乙醇体积分数为80％～90％，边加边搅拌。
[0022]优选地，步骤(4)中，所述干燥是在真空干燥箱中进行干燥，干燥温度为25℃。
[0023]与现有技术相比，本专利技术取得的积极有益效果如下：
[0024](1)本专利技术血促性素提取纯化方法中采用偏磷酸对孕马血清进行分离处理时，将孕马血清的pH设置为4.5～5.0，该pH范围能够减少偏磷酸分离处理过程中血促性素糖链分解、失活，提取得到的血促性素收率高、效价高，有效避免了偏磷酸分离处理过程中因pH值过低(pH为3.0～3.5)引起血促性素糖链分解、失活，导致血促性素收率低、效价低的技术问题。
[0025](2)本专利技术在进行亲和层析前对血促性素粗品溶液进行第一次超滤处理，在进行阳离子交换层析前对血促性素粗品溶液进行第二次超滤处理，超滤处理能够去除溶液中的小分子蛋白杂质，同时还能降低血促性素粗品溶液的电导率。通过第一超滤处理能够将血促性素粗品溶液的电导率为10～15ms/cm，该电导率能够保证后续亲和层析处理过程中血促性素能吸附在层析柱上并可以用洗脱缓冲液洗脱，有效解决了第二沉淀处理过程中高浓度乙醇导致部分偏磷酸析出致使血促性素粗品盐浓度高，亲和层析时血促性素无法吸附在
层析柱上直接流穿层析柱的技术难题。通过第二超滤处理能够将血促性素粗品溶液的电导率为7～10ms/cm，该电导率能够保证后续阳离子交换层析处理过程中血促性素能吸附在阳离子交换层析柱上并可以用洗脱缓冲液洗脱，有效解决了亲和层析得到的含血促性素洗脱缓冲液盐浓度高，阳离子交换层析时血促性素无法吸附在阳离子交换层析柱上直接流穿层析柱的技术难题。
[0026](3)本专利技术通过血促性素提取纯化方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血促性素提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）采用偏磷酸调节孕马血清的pH为4.5～5.0，然后进行固液分离，收集上清液；（2）采用第一沉淀剂对所述上清液进行沉淀处理，固液分离，收集滤液；（3）采用第二沉淀剂对所述滤液进行沉淀处理，固液分离，收集沉淀物，沉淀物经干燥处理，得到血促性素粗品；（4）将所述血促性素粗品溶解，得到血促性素粗品溶液；将血促性素粗品溶液依次进行第一超滤、亲和层析、第二超滤、阳离子交换层析处理，得到血促性素粗品过滤液；采用第三沉淀剂对血促性素粗品过滤液进行沉淀处理，收集沉淀物，沉淀物经干燥处理，得到血促性素纯品。2. 根据权利要求1所述的血促性素提取纯化方法，其特征在于，所述亲和层析采用的层析基质为Blue Sepharose 6 Fast Flow。3.根据权利要求2所述的血促性素提取纯化方法，其特征在于，亲和层析过程中上样后先采用洗涤液冲洗亲和层析柱，然后采用洗脱缓冲液进行洗脱；所述亲和层析采用的洗涤液为氯化钠和磷酸二氢钠的混合水溶液，洗涤液的电导率为10～15ms/cm，洗涤液中磷酸二氢钠的浓度为0.05mol/L，氯化钠的浓度为0.07mol/L；亲和层析采用的洗脱缓冲液为氯化钠溶液，氯化钠溶液的电导率为40～50ms/cm。4. 根据权利要求1～3任一所述的血促性素提取纯化方法，其特征在于，所述阳离子交换层析采用的层析基质为SP
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Sepharose Fast Flow。5.根据权利要求4所述的血促性素提取纯化方法，其特征在于，阳离子交换层析过程中上样后先采用洗涤液冲洗阳离子交换层析柱，然后采用洗脱缓冲液进行洗脱；所述阳离子交换层析采用的洗涤液为氯化钠和醋酸钠的混合水溶液，洗涤液的电导率为10～15ms/cm，洗涤液中醋酸钠的浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：高伟，郑扶桑，赵文蒙，杜丽娟，宋祺，王萍，张富源，余彬，
申请(专利权)人：河南美森药业有限公司，
类型：发明
国别省市：