转基因表达系统技术方案

描述了将载体衍生转基因的表达限制在减轻致病的遗传缺陷而不产生过表达毒性的窗口内的系统。这提供了“剂量不敏感性”，由此接受更多载体衍生转基因的细胞或组织通过可以适应性调节的内置单个基因回路受不成比例地抑制。制。制。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】转基因表达系统
专利

[0001]基因疗法的目标在于递送治疗性转基因以影响遗传疾病的矫正。本专利技术提供了构建体以在接受不同水平的载体衍生转基因的细胞间生成相对固定水平的表达。本文还描述了控制基因表达的方法，其中使用所描述的基因回路提供控制。
[0002]专利技术背景
[0003]虽然已知递送治疗性转基因以影响遗传疾病的矫正的基因疗法概念，但许多基因是高度剂量敏感的，由此基因产物的表达过少或过多都可以产生有害的影响。病毒介导的基因转移是向靶组织和靶细胞(包括神经系统的细胞)递送治疗性转基因的有力的手段。高病毒滴度通常是实现有效的系统范围的转导以获得最佳的治疗效果所必需的。然而，在一些细胞中同样高的滴度可能由于超生理的转基因表达水平而造成过表达毒性。需要有效的系统以将载体衍生转基因的表达限制在减轻致病的遗传缺陷而不产生过表达毒性的窗口内。
[0004]WO2016040395讨论了合成RNA回路用于基因转移的用途。该回路包括包含由在细胞类型中特异性表达的第一microRNA识别的至少一个序列和编码特异性结合于RNA基序并抑制蛋白质产生的蛋白质的序列的第一RNA分子。将第一microRNA描述为miR
‑
21。还提供了包含在RNA基序处由不在该细胞类型中表达的第二microRNA识别的序列和编码输出分子的序列的第二RNA分子。将第二microRNA描述为miR
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141、miR
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142和miR
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146。该申请描述了不同细胞(癌细胞或非癌细胞)的输出蛋白的差异表达依赖于这些细胞提供的内源性miR。
[0005]Strovas TJ,Rosenberg AB,Kuypers BE,Muscat RA,Seelig G.MicroRNA
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based single
‑
gene circuits buffer protein synthesis rates against perturbations.ACS Synth Biol.2014；3(5):324
‑
331讨论了基于单个基因microRNA(miRNA)的前馈环路的用途。它提供了靶向其自身转录本的内含子miRNA。Strovas考虑了哺乳动物细胞中工程化的遗传程序的长期稳定表达的困难。该工作利用了基因回路，其中将含有小鼠mir
‑
124
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3基因的内含子插入红色荧光报告物(mCherry)中。前mRNA从多西环素诱导型启动子转录，导致mir
‑
124和mCherry的共表达。miRNA和mCherry转录本之间的阻遏性调节联系由mir
‑
124调节的Vamp3基因的3
’
UTR的截短型式提供给mRNA。
[0006]虽然WO2016040395讨论了在正常细胞和癌细胞中使用不同表达的内源性miR来提供表达，但这种miR的使用在非癌症疾病的治疗中的用途受限。专利技术人还已经确定，Stovas的现有方法将对已知受到内源性miRNA(如本文中使用的miR124)调节的多种基因具有多重脱靶效应。事实上，已知miR124与多种癌症相关，因此其将不适用于基因疗法。因此，提供内源性microRNA可能存在问题，因为除了转基因外还可能提供内源性靶标。
[0007]本专利技术的专利技术人已寻求提供比本领域提供的构建体更具优势的替代构建体。
[0008]专利技术概述
[0009]专利技术人已经确定了将载体衍生转基因的表达限制在减轻致病的遗传缺陷而不产生过表达毒性的窗口内的系统，以实现专利技术人所称的“剂量不敏感性”，由此接受更多载体衍生转基因的细胞或组织通过可以适应性调节的内置单个基因回路受不成比例地抑制。也
就是说，载体衍生转基因在高载体剂量情况下被下调使得该回路在一系列载体剂量间维持相对稳定的表达水平，结果是整个细胞群体表达更均匀和更受控的载体衍生转基因的水平。与常规的基因疗法盒相比，提高载体剂量将导致细胞群体内更多的细胞表达转基因但不伴随过表达的增加。，通常接受高载体负载(如心脏、肝脏和背根神经节中)的敏感细胞类型也将不容易受到通过这种机制的超感染介导的过表达的影响。
[0010]本申请的专利技术人已经设计了合成或非哺乳动物miRNA构建体，其克服与基于哺乳动物的miRNA构建体相关联的展现出脱靶效应风险的缺点。专利技术人已经证明非哺乳动物或完全合成的(自然界中未知的)miRNA以确保宿主(人基因组)内不存在靶标的效用。
[0011]此外，专利技术人已经确定可以如何使用此类合成的组分以容许对系统进行微调(位点数量和高效的内含子排除)以实现适当的剂量不敏感性。
[0012]因此，本专利技术的第一方面提供了构建体，其包含：
[0013]‑
启动子；
[0014]‑
在内含子内表达的至少一个非哺乳动物或合成miRNA，其中该合成miRNA是非天然存在的序列；
[0015]‑
转基因；
[0016]‑
一个或多个非哺乳动物或合成miRNA结合位点，其提供对转基因的表达的控制，其中该合成miRNA结合位点不天然存在；和
[0017]‑
多腺苷酸化信号。
[0018]本文讨论的mRNA结合位点是合成衍生的以与哺乳动物细胞中存在的哺乳动物序列不同，或是由另一种非哺乳动物物种(例如昆虫)提供。当miRNA结合位点来自昆虫而不存在于哺乳动物序列中(例如ffluc1)时，可以使用非哺乳动物系统。miRNA结合位点和非哺乳动物或合成miRNA的组合使构建体的脱靶调节效应最小化。这容许调节转基因的表达以提供期望的转基因剂量(表达)。
[0019]合适地，提供对转基因的表达的控制的miRNA结合位点可以在3
’
UTR、5
’
UTR和/或转基因内提供。合适地，当在转基因中提供时，miRNA结合位点可以是密码子优化的使得其提供合成或非哺乳动物结合位点但不影响转基因蛋白的氨基酸序列。该构建体可以用于提供容许表达控制的前馈环路。
[0020]合适地，可以包括增加转基因表达的稳定性元件。合适地，稳定性元件可y位于3
’
UTR中。合适地，该稳定性元件可以是土拨鼠肝炎病毒(WHV)转录后调节元件(WPRE)(SEQ ID NO:74)。WPRE是含有γ、α和β元件的三方调节元件。合适地，稳定性元件可以是保留稳定性元件但省略X蛋白序列或核酶稳定性序列的WPRE的截短型式(WPRE3)(SEQ ID NO:75)。WPRE3是缩短的WPRE序列，其含有WPRE的三个调节元件中的两个(最小的γ和α元件)。合适地，WPRE3稳定性元件提供了在经加工的转录本中产生三级结构的DNA序列，这增强了转基因表达。
[0021]合适地，可以将不同的启动子与一系列转基因一起使用。在本专利技术中，可以调整前馈回路的强度以容许控制转基因的表达水平。这提供了剂量敏感性。调整单个本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.构建体，其包含：
‑
启动子；
‑
在内含子内表达的至少一个非哺乳动物或合成miRNA，其中所述合成miRNA是非天然存在的序列；
‑
转基因；
‑
至少一个非哺乳动物或合成miRNA结合位点，其提供对所述转基因的表达的控制，其中所述合成miRNA结合位点是非天然存在的序列；和
‑
多腺苷酸化信号。2.权利要求1的构建体，其中提供对所述转基因的表达的控制的所述miRNA结合位点在3
’
UTR或5
’
UTR内提供。3.权利要求1的构建体，其中所述非哺乳动物或合成miRNA结合位点在所述转基因内提供。4.如前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述构建体提供单个基因回路以在接受不同水平的载体衍生转基因的细胞间提供相对固定的所述转基因的表达水平(即剂量不敏感性)。5.如前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述至少一个合成或非哺乳动物miRNA不表现出脱靶结合效应。6.如前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述非哺乳动物或合成miRNA在由以下提供的内含子中表达人_EF1a_内含子_A(SEQ ID NO:5)gtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcttgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcag>MINIX_人工_内含子(SEQ ID NO:6)Gtaagagcctagcatgtagaactggttacctgcagcccaagcttgctgcacgtctagggctcaccgggtttccttgatgaggtaccgacatacttatcctgtcccttttttttccacag。7.如前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述miRNA是衍生自昆虫miRNA的非哺乳动物miRNA，任选地，其中所述miRNA能够与萤火虫萤光素酶(ffluc1)miRNA结合位点特异性结合。
8.如前述权利要求中任一项所述的构建体，其中在所述构建体中提供多个miRNA结合位点，任选地，三个miRNA结合位点、至少四个miRNA结合位点、至少五个miRNA结合位点、至少六个miRNA结合位点。9.如前述权利要求中任一项所述的构建体，其中在构建体中表达多个非哺乳动物或合成miRNA。10.如前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述非哺乳动物萤火虫萤光素酶miRNA是选自以下的序列>ffluc1(SEQ ID NO:9)tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaaacgatatgggctgaatacaatagtgaagccacagatgtattgtattcagcccatatcgttgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt>ffluc9(SEQ ID NO:10)tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaaacgtgaattgctcaacagtatagtgaagccacagatgtatactgttgagcaattcacgttgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt>ffluc18(SEQ ID NO:11)tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgacccgacgatgacgccggtgaatagtgaagccacagatgtattcaccggcgtcatcgtcggggtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt>ffluc22(SEQ ID NO:12)tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgattcgatagggacaagacaatttagtgaagccacagatgtaaattgtcttgtccctatcgaagtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt。11.如权利要求1至6或8至9中任一项所述的构建体，其中所述合成miRNA是选自以下的序列>新的_序列_1(SEQ ID NO:13)tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagcatgttacgggacttcttattagtgaagccacagatgtaataagaagtcccgtaacatgcgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt
>新的_序列_2(SEQ ID NO:14)tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagtgaggagcagcggatcttaatagtgaagccacagatgtattaagatccgctgctcctcacgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt>新的_序列_3(SEQ ID NO:15)tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagtcatgtcgtcacggaacttatagtgaagccacagatgtataagttccgtgacgacatgacgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt>新的_序列_4(SEQ ID NO:16)tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagagaagtgcggatttcgtatttagtgaagccacagatgtaaatacgaaatccgcacttctcgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt>新的_序列_5(ran1g)(SEQ ID NO:17)tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaaagcgccaaaggagtctgtgatagtgaagccacagatgtatcacagactcctttggcgcttgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt>新的_序列_6(ran2g)(SEQ ID NO:18)tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaaagtgcggatttcgtatttgctagtgaagccacagatgtagcaaatacgaaatccgcacttgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt>新的_序列_7(SEQ ID NO:19)tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaaagtggatgcgatgcgattgctagtgaagccacagatgtagcaatcgcatcgcatccacttgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt>新的_序列_8(SEQ ID NO:20)Tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaaacggtatccgcaacttgc
gatagtgaagccacagatgtatcgcaagttgcggataccgttgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt。12.如前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述合成miRNA靶向靶基因的编码序列并且选自>MECP2_编码_1(SEQ ID NO:21)tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaaagtacgatgtttacttgatctagtgaagccacagatgtagatcaagtaaacatcgtacttgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt>MECP2_编码_2(SEQ ID NO:22)tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaaagccgctcttggtctctacctagtgaagccacagatgtaggtagagaccaagagcggcttgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt>MECP2_编码_3(SEQ ID NO:23)tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaaagtccgaagatcaagacctgtagtgaagccacagatgtacaggtcttgatcttcggacttgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt>MECP2_编码_4(SEQ ID NO:24)tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagagtccagtatacgcagtgtatagtgaagccacagatgtatacactgcgtatactggactcgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt>MECP2_编码_5(SEQ ID NO:25)tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagtccagtatacgcagtgtacatagtgaagccacagatgtatgtacactgcgtatactggacgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt>MECP2_编码_6(SEQ ID NO:26)Tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagactcgggaaaccgttagtattagtgaagccacagatgtaatactaacggtttcccgagtcgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaat
tcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt>SYNGAP1_编码_1(SEQ ID NO:27)tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagcgccttaagtccagcataaatagtgaagccacagatgtatttatgctggacttaaggcgcgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt>SYNGAP1_编码_2(SEQ ID NO:28)tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagagttctgtttcgaagttacttagtgaagccacagatgtaagtaacttcgaaacagaactcgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt>SYNGAP1_编码_3(SEQ ID NO:29)tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaggcgagcacttcgagttcaattagtgaagccacagatgtaattgaactcgaagtgctcgccgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt>SYNGAP1_编码_4(SEQ ID NO:30)tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacactt...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：爱丁堡大学理事会，
类型：发明
国别省市：