EAAT1/SLC1A3抑制剂在制备治疗肝癌药物的应用制造技术

本发明专利技术公开EAAT1/SLC1A3作为肝癌治疗的新靶点，EAAT1/SLC1A3抑制剂在制备治疗肝癌药物的应用。本发明专利技术使用了特异性靶向EAAT1/SLC1A3的抑制剂UCPH

【技术实现步骤摘要】
EAAT1/SLC1A3抑制剂在制备治疗肝癌药物的应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及兴奋性氨基酸转运体1(EAAT1)/溶质载体家族1成员3(SLC1A3)抑制剂UCPH
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101和靶向SLC1A3基因在肝癌治疗药物中的应用。

技术介绍

[0002]肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率呈现逐年上升的趋势。数据显示2020年我国大约有39万人死于肝癌，死亡人数居我国恶性肿瘤死亡第二位。目前，早期手术切除是肝癌最主要和最有效的治疗手段，但大部分患者经常在病情晚期才自觉症状或就医确诊，耽误了最佳的治疗时期，导致患者预后生存率差和总体治疗效果不理想。此外，尽管放疗、介入治疗和肝移植等治疗方法取得一定进展，但由于放化疗的副作用及供肝稀缺等问题的限制，上述方法的总体疗效仍然很难令人满意。
[0003]肿瘤分子靶向治疗作为一种新型疗法，已逐步成为临床肿瘤治疗的重要手段。该疗法以肿瘤细胞的标志性分子为治疗靶点，通过有效的阻断剂干预细胞发生癌变的各个环节，比如抑制肿瘤细胞增殖、干扰细胞周期、诱导细胞分化、抑制肿瘤细胞转移、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤新生血管生成等，从而达到治疗肿瘤的目的。因此，与传统肿瘤治疗手段相比，具有更好的精准性，能选择性地杀伤肿瘤细胞，对正常组织损伤较低或无损伤，副作用小，不易产生耐药性。但目前该治疗方法的瓶颈问题是用于分子靶向治疗的分子靶向药物非常有限，其关键原因在于有效的分子靶点数量不足，迫切需要寻找新的特异性分子靶点。
[0004]溶质载体家族1成员3(the solute carrier family 1member 3gene，SLC1A3)，通常被称为谷氨酸天门冬氨酸转运体(gutamate/apartate tansporter，GLAST)，也被称为兴奋性氨基酸转运体1(excitatory amino acid transporter 1，EAAT1)，是一种重要的兴奋性氨基酸转运载体，在动物的多种组织器官中均有表达，其主要功能是负责细胞膜内外谷氨酸和天冬氨酸的转运，对学习、记忆、中枢神经系统疾病和生长发育具有重要的调节作用。SLC1A3最近还被证明参与肿瘤代谢和肿瘤进展，数据表明其在多种癌组织中表达异常，并可以作为胶质母细胞瘤、软骨肉瘤、结直肠癌及胃癌等的肿瘤标志物，是潜在的肿瘤治疗分子靶点。
[0005]尽管有研究称，EAAT1/SLC1A3在多种癌组织中显著高表达，其可以作为潜在的肿瘤治疗靶点，但在目前在肝细胞癌中靶向SLC1A3抑制其mRNA和蛋白水平的表达以及使用其抑制剂UCPH
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101对于肝癌的治疗作用还未见报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的主要目的就是针对现有技术中的问题，提供一种EAAT1/SLC1A3抑制剂在制备治疗肝癌药物的应用。
[0007]本专利技术的目的之一是提供EAAT1/SLC1A3作为肝癌治疗的新靶点，EAAT1/SLC1A3抑制剂在制备治疗肝癌药物的应用。药物可以包括该抑制剂的活性成分以及药物上可以接受
Protein Atlas、DRUGBANK、Open Targets和GTEx，提供关于所选基因和靶点的额外信息。
[0021]通过UALCAN数据分析平台分析发现，结果如图1所示，在肝细胞癌患者的癌组织(Primary Tumor)中，SLC1A3的mRNA表达水平(Transcript per million)明显高于正常健康人肝组织或者肝细胞癌患者的癌旁组织(Normal)，即SLC1A3在人肝细胞癌组织或细胞中表达上调。这提示干预SLC1A3基因的表达可能成为肝癌治疗的新途径。
[0022]为了验证这一设想，本专利技术使用了特异性靶向EAAT1/SLC1A3的抑制剂UCPH
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101并构建了靶向SLC1A3的特异性基因敲除系统，使得SLC1A3在肝癌细胞中表达降低或功能阻断，再进一步评价SLC1A3功能阻断或基因敲除对肝癌细胞增殖能力的影响。
[0023]在本专利技术中，术语EAAT1(excitatory amino acid transporter 1)和SLC1A3(the solute carrier family 1member 3gene)是指SLC1A3基因或者EAAT1蛋白、或其同源物、或具有其生物活性的变体形式，优选为人SLC1A3基因(在NCBI中的基因ID：6507)。
[0024]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025]本专利技术所述SLC1A3抑制剂包括了核酸抑制物、拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等，即，能够下调SLC1A3的表达水平，抑制谷氨酸天门冬氨酸转运体(GLAST)或者奋性氨基酸转运体1(EAAT1)的活性或功能。可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。
[0026]另外，本专利技术包括使用基因编辑的手段，通过定向的基因编辑来定向地抑制或下调基因的表达，这种手段以及试剂也可被应用于本专利技术中，制备SLC1A3抑制剂。
[0027]实施例1
[0028]肝癌细胞的培养、扩增和传代
[0029]选用人肝癌细胞系中HepG2、Hep3B、Huh7，在DMEM培养基中生长。
[0030]所述DMEM培养基中含有青霉素(100U/ml)及链霉素(100mg/ml)和10％胎牛血清(FBS)。
[0031]上述细胞在37℃、在5％浓度CO2细胞培养箱内培养。
[0032]实施例2
[0033]人肝癌细胞中SLC1A3的mRNA表达情况的检测
[0034](1)肝癌细胞总RNA的提取
[0035]人肝癌细胞系HepG2、Hep3B、Huh7在6cm培养皿中培养至80
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90％融合度时，用PBS洗涤2次，加入1mL Trizol试剂裂解细胞，并移至无酶EP管中；向无酶EP管中加入200μL氯仿，充分震荡混匀15s，室温静置5min后置于4℃超速离心机，12000rpm离心15min；将上层含有RNA的水相移入新的无酶EP管中，作好相应标记，加入500μL异丙醇，振荡器上充分震荡混匀，置于4℃超速离心机，12000rpm离心10min；完全弃除上清，沉淀即为RNA，然后加入提前配制的1mL 75％乙醇，振荡器上充分混匀后于4℃超速离心机，7500rpm离心5min；完全弃除上清，风干沉淀后加入无酶水20μL，并测定RNA浓度及纯度，标记好后置于
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80℃超低温冰箱保存。
[0036](2)反转录成cDNA
[0037]采用诺唯赞公司的HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒，按说明书操作，分为两步：第一步去除提取的总RNA中的基因组DNA，取上述总RNA 1μg本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.EAAT1/SLC1A3抑制剂在制备治疗肝癌药物的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，EAAT1/SLC1A3抑制剂为UCPH
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101。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，EAAT1/SLC1A3抑制剂为敲除SLC1A3的CRISPR/Cas9基因编辑系统，用于降低EAAT1/SLC1A3表达。4.根据权利要求3所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫居明，邵斯旻，胡静，居晓曼，袁东晨，孙国伟，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：