SETX基因在作为抑制卵巢癌癌细胞增殖和提高化疗药物敏感性靶标中的用途制造技术

本发明专利技术涉及Senataxin(SETX)基因新的作用底物及用途，属于分子医学技术领域。本发明专利技术发现敲除SETX基因具有抑制卵巢癌细胞增殖和提高化疗药物敏感性的用途；本发现检测结果显示SETX基因在卵巢癌组织和细胞中表达量明显增加，这提示SETX蛋白可能在卵巢癌发生中发挥重要作用，并通过构建SETX敲除的OVCAR

【技术实现步骤摘要】
SETX基因在作为抑制卵巢癌癌细胞增殖和提高化疗药物敏感性靶标中的用途


[0001]本专利技术通过敲除SETX基因达到抑制卵巢癌增殖的新用途，属于分子医学


技术介绍

[0002]卵巢癌是妇科的恶性疾病，致死率在所有妇科癌症中居第1位。由于缺少特殊的临床症状和有效的筛检手段，患者被确诊为卵巢癌时往往已是晚期，预后亦比其他癌症差。因此，寻找新的卵巢癌治疗手段对提高治疗效果具有重要意义。
[0003]随着精准医疗技术的飞速发展，癌症治疗观念也发生了根本性的转变，即由经验科学向循证医学、由细胞攻击模式向靶向治疗模式转变。靶向治疗，即在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点，来设计相应的治疗药物，药物进入人体后，将精确地与致癌位点结合并发生作用。其治疗作用主要限定在让肿瘤细胞死亡，而不影响正常细胞、组织或器官的功能，从而提高疗效、减少毒副作用。
[0004]因此，开发具有对肿瘤细胞抑制作用的新的分子靶标具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一个目的，提供了：
[0006]敲除SETX基因guide RNA序列的试剂用于制备抑制卵巢癌细胞增殖的小分子抑制剂用途。
[0007]本专利技术的第二个目的，提供了：
[0008]敲除SETX基因的试剂在用于制备促进肿瘤细胞DNA损伤的试剂中用途。
[0009]本专利技术的第三个目的，提供了：
[0010]敲除SETX基因的试剂在用于制备阻滞肿瘤细胞周期、促进细胞衰老的试剂中用途。
[0011]本专利技术的第四个目的，提供了：
[0012]敲除SETX基因的试剂在用于制备提高肿瘤细胞化疗药物敏感性的试剂中用途。
[0013]有益效果
[0014]本专利技术通过构建敲除SETX基因的肿瘤细胞，发现了SETX基因的表达显著影响到了肿瘤细胞的增殖、细胞周期、衰老、化疗药物敏感性的相关特性。
附图说明
[0015]图1是SETX在卵巢癌组织和细胞中表达量的相关结果；
[0016]图2是SETX缺失抑制卵巢癌细胞增殖和迁移的相关结果；
[0017]图3是SETX缺失促进卵巢癌细胞凋亡、衰老和DNA损伤的相关结果；
[0018]图4是SETX缺失抑制体内肿瘤增殖的相关结果；
[0019]图5是SETX缺失提高化疗药物敏感性的相关结果。
具体实施方式
[0020]材料和方法
[0021](一)材料：
[0022]cDNA逆转录试剂盒和Q
‑
PCR试剂盒购自TAKARA。DL2000 DNA Marker、PCR产物回收试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒均购自Axygen公司。β
‑
半乳糖苷酶细胞衰老检测试剂盒,β
‑
Actin、PARP、p
‑
HistonH3、p
‑
H2AX等一抗和各种二抗均购自CST公司。SETX抗体购自Novus公司。细胞周期检测试剂盒和Annexin V
‑
FITCPI双染细胞凋亡检测试剂盒均购自CST有限公司。DMEM细胞培养液、PBS、0.25％胰酶+0.2％EDTA、FBS均购自Gibco。DH5α由本实验室保存。
[0023](二)细胞培养
[0024]肿瘤细胞株OVCAR
‑
3和ES
‑
2均购自ATCC。肿瘤细胞在添加10％胎牛血清(Hyclone)和1％青霉素
‑
链霉素(Gibco)溶液的DMEM培养基中，在37℃、加湿的5％ CO2培养箱中培养。
[0025](三)裸鼠和异种移植模型
[0026]裸鼠的饲养光照/黑夜时间为14小时/10小时，有亮有暗，并随时提供食物和水。所有的动物实验都是按照NIH的实验动物护理和使用指南进行的。为了评估增殖，我们将卵巢癌细胞皮下注射到8周大的雌性裸鼠体内。4周后，原发肿瘤团块用4％ PFA固定，石蜡包埋。切片(5mm厚)，做免疫组织化学。
[0027](四)逆转录病毒感染
[0028]通过CRISPR基因组编辑技术创建SETX缺失细胞。慢病毒感染产生稳定表达空载体SETX敲除的OVCAR
‑
3和ES
‑
2细胞。293T慢病毒包装细胞转染pLentiV2空载体或pLentiV2
‑
SETX敲除构建物。转染48小时后，用慢病毒培养液培养OVCAR
‑
3和ES
‑
2细胞。感染48小时后，在培养液中用2
‑
4μg/ml嘌呤霉素筛选细胞。
[0029](五)软琼脂克隆形成实验
[0030]配制0.5％下层胶，取1.5ml混合液铺于六孔板室温静置15min待凝固，将细胞悬浮在含有1
×
细胞培养基和10％胎牛血清的1.5ml 0.35％琼脂中，倒于下层。待胶凝固后加入2ml新鲜DMEM培养液，每2～3d换液。每次实验使用三份培养物。将平板置于37℃5％ CO2加湿培养箱中。14～20d后用结晶紫染色后菌落计数。
[0031](六)Transwell细胞迁移实验
[0032]使用带有8m孔过滤器和生物膜基质的24孔组织培养平板插入物评估转染了对照OVCAR
‑
3和ES
‑
2WT及其SETX敲除细胞的迁移和侵袭能力。细胞计数，Transwell培养板下室加入500μl正常培养基，取1
×
104细胞于上室，并加入200μl无血清培养液。37℃孵育24小时后，用湿棉签轻轻擦去Transwell上表面细胞，已经迁移的细胞附着在下表面。预冷的冰甲醇固定30min，苏木精染色30s后观察，交叉井用水冲洗并风干。采用Image
‑
Pro Plus6.0软件对阳性细胞进行定量。
[0033](七)PE Annexin V染色检测细胞凋亡
[0034]OVCAR
‑
3和ES
‑
2WT及其SETX缺陷细胞在6孔板中培养，用冷的2mL 1
×
PBS洗涤3次，用1mL 1
×
buffer重悬细胞，取1
×
105个细胞按PE
‑
Annexin V染色按照试剂盒说明操作，室
温避光放置15min后检测。
[0035](八)小鼠和异种移植模型
[0036]小鼠在标准条件下饲养，光照/黑夜时间为14小时/10小时，并随时提供食物和水。所有的动物实验都是按照NIH的实验动物护理和使用指南进行的。为了评估体内癌细胞的增殖，我们将OVCAR
‑
3和ES
‑
2WT及其SETX缺失细胞(5
×
105)皮下移植到8周龄雌性裸鼠的背侧，每组6
‑
8只小鼠。三周后，从裸鼠身上收集原发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.敲除SETX基因guide RNA序列的试剂用于制备抑制卵巢癌细胞增殖的小分子抑制剂用途。2.敲除SETX基因的试剂在用于制备促进肿瘤细胞DNA损伤的试剂中用途。3.敲除SETX基因的试剂在用于制备阻滞肿瘤细胞周期、促进细胞衰老的试剂中用途。4.敲除SETX基...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘巍巍，徐图南，王晓敏，高圆圆，刘寒峭，刘宁书，龚亮，程树群，
申请(专利权)人：嘉兴学院，
类型：发明
国别省市：