修饰的人可变域制造技术

本发明专利技术涉及一种修饰的人可变域。本发明专利技术提供了包含修饰的人、人源化或嵌合免疫球蛋白重链可变域的多肽。还提供了相应抗体、变体、片段、核酸、载体、噬菌体、文库、方法和试剂盒。方法和试剂盒。方法和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
修饰的人可变域
[0001]本申请是申请日为2020年08月04日，申请号为202080055880.6，专利技术名称为“修饰的人可变域”的专利技术专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术提供了包含修饰的人、人源化或嵌合免疫球蛋白重链可变域的多肽。还提供了相应抗体、变体、片段、核酸、载体、噬菌体、文库、方法和试剂盒。

技术介绍

[0003]治疗性蛋白，如抗体含有一些翻译后修饰，它们中的一些对蛋白具有潜在不希望的影响。例如，焦谷氨酸(pyroglutamate，焦谷氨酸盐)(通常缩写为pE、pyroE或pyroGlu)可以在多肽链的N
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末端体外和体内形成。焦谷氨酸的形成通过在该位置最初合成的谷氨酸或谷氨酰胺残基的重排发生(参见图1)。
[0004]如通过种系VH基因节段重排所编码的人、人源化或嵌合抗体重链可变(VH)域的N
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末端的第一个残基通常是谷氨酰胺或谷氨酸。抗体N
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末端的谷氨酰胺和谷氨酸两者已显示体外自发环化为焦谷氨酸。当通过谷氨酰胺环化形成焦谷氨酸时，所产生的抗体变得酸性更强。相反地，当通过谷氨酸环化形成焦谷氨酸时，所产生的抗体变得酸性降低。随时间，这可能导致抗体制备中的电荷不均一，这在多种背景中可能是不期望的。降低抗体制备中的这种可变性可以是有益的。
[0005]然而，谷氨酰胺或谷氨酸在VH域的N
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末端的存在可以是重要的。的确，在抗体从原核和真核细胞分泌期间，通过信号肽和重链可变域之间的切割，从未成熟的重链的N
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末端除去信号肽(SP；也称为前导肽)。信号肽切割效率取决于信号肽序列以及VH域的序列。信号肽肽酶(如SPaseI)所识别的肽节段延伸至成熟蛋白的起始(Choo等人,2008)。VH域中的侧接残基因此可以影响信号肽酶处理并有助于非典型切割位点。

技术实现思路

[0006]本文已意外地发现可以向人、人源化或嵌合VH域的N
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末端引入氨基酸改变，同时保留相应未修饰的人、人源化或嵌合VH域所要求的亲和性(affinity，亲和力)、特异性和/或结构相互作用。有利地，这降低了包含修饰的人、人源化或嵌合VH域的蛋白制剂(例如，抗体制剂)中的可变性(例如，电荷不均一性)。
[0007]因此，本文首次提供了新的抗体、重链可变区、变体、片段、核酸、载体、噬菌体、文库、方法和试剂盒，其包含缺少谷氨酰胺或谷氨酸的修饰的N末端残基，同时不会有害地影响信号肽切割或蛋白表达。此外，描述了抗体产生方法，其中可以修饰人、人源化或嵌合抗体、重链可变区和编码它们的核酸的整个组以普遍除去N末端谷氨酰胺或谷氨酸，从而允许这些人抗体、重链可变区的整个组从头开始展示、测定和评价，没有这种残基，避免了先导候选鉴定(lead candidate identification)时实施下游修饰的任务，节约时间并减少工作，并且优选地同时不会有害地影响信号肽切割或蛋白表达。
[0008]此外，当通过展示技术或者在功能测定中产生要对于活性进行筛选的重链或抗体组时，期望测试这些蛋白，因为它们将处于其最终形式以避免这种分析中的结果的可变性并且基于可以在下游生产中使用的变体，避免不得不进行多轮相同分析。然而，常规做法是分析重链或抗体以除去可以仅在前导，如抗体已鉴别后并且在进行了功能性表征后导致翻译后修饰的残基。然后，可以通过本领域中已知的多种重组技术，包括通过核酸突变或通过核酸合成，从而导致编码改变否则在储存期间将产生潜在改变的残基的变化的新序列，改变具体残基。例如，在免疫动物(或另外的转基因动物)的B细胞的免疫和收集后或者在分析所产生的抗体的杂交瘤或文库产生前，必须特异性改变由抗体产生所产生的每种蛋白是费力且费时的方法。因此，在本文中已开发了通过改变N末端谷氨酰胺和谷氨酸来修饰整个包含人、人源化或嵌合VH域的抗体、重链或可变区的组的新型方式。
[0009]其它优势在于可以使用包含编码信号肽的核酸和包含VH域的第一或前两个氨基酸的标准载体，所述VH域的第一氨基酸不是谷氨酰胺或谷氨酸，并且其中至少所述第一或前两个氨基酸不同于未修饰的VH域，在本文中其也称为参考亲代可变区或常规人、人源化或嵌合VH域。这种载体可以用于宿主细胞以产生包含如本文所描述的修饰的VH域的抗体或重链组，并且进一步改善生产抗体的稳健性和效率。
[0010]修饰在免疫和组产生后并且在产生展示文库前所产生的每个抗体或重链的另一种复杂性在于以下考虑：这样做，可以阻碍负责抗体或重链在细胞表面展示的信号肽，从而损害展示温度的宽度和稳健性。
[0011]可以将氨基酸变化引入人、人源化或嵌合VH域的N
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末端的事实允许更有效的产生抗体的方法，因为与已选择一个或多个前导候选之后相反，可以在抗体组产生期间进行修饰。
[0012]如本文所示，除去人、人源化或嵌合VH域N
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末端的谷氨酰胺或谷氨酸并用另一种氨基酸(如丙氨酸)替换该残基消除了任何蛋白，如抗体N
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末端的自发焦谷氨酸形成，从而引入了修饰的可变域。有利地，引入修饰的人、人源化或嵌合VH域的Fabs和噬菌体展示文库的成功产生证实修饰的人、人源化或嵌合VH域保留了相应未修饰的人、人源化或嵌合VH域的所需要的亲和性、特异性和/或结构相互作用。此外，通过使用通用引物，所使用的方法允许产生整个人重链可变区或抗体组，其N
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末端的这种谷氨酰胺或谷氨酸被除去，而不考虑哪种V基因节段产生了所述可变区，从而允许对这些组进行均一测试并引入高通量筛选。
[0013]一些优势可以与消除焦谷氨酸形成有关。如上所述，焦谷氨酸的存在可以改变抗体酸度，其可以导致抗体降解或影响货架期。此外，已报道一旦在患者中输注，具有超过特定阈值水平的低PH的抗体将引起疼痛。消除焦谷氨酸形成将消除这些潜在不利的性质。此外，出于调控目的，焦谷氨酸的消除也是有益的，因为，例如，欧洲药品管理局(European Medical Agency)指南要求生物制品的申请人监测一些结构特征，包括聚集状态，N
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和C
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末端(重链N
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末端的焦谷氨酸和C
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末端的赖氨酸)。N末端焦谷氨酸的消除将通过消除这种监测变化而使得管理审查变得容易。N末端焦谷氨酸的不存在还可以导致抗体货架期增加。消除焦谷氨酸形成还提供了更大的过程控制并且可以对与这种N末端谷氨酰胺或谷氨酸残基有关的疾病具有益处。N末端焦谷氨酸的不存在还确保抗体中电荷不均一性的降低并因此使得基于电荷的纯化和分离更有效。在不存在焦谷氨酸的情况下，N末端修饰的添加以及后续分析还可以更容易。
[0014]本专利技术人还意外地鉴别这种氨基酸变化可以改善信号肽从未成熟的人、人源化或嵌合VH域的N
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末端的有效切割。例如，丙氨酸残基(任选地与其它第二残基，例如，丙氨酸
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脯氨酸、丙氨酸
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天冬氨酸、丙氨酸
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多肽，包含人、人源化或嵌合免疫球蛋白重链可变域，其中，所述可变域包含：
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选自由下述组成的组的N末端氨基酸：精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸；或
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选自由下述组成的组的N末端序列：丙氨酸
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脯氨酸、丙氨酸
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天冬氨酸、丙氨酸
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谷氨酸、丙氨酸
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苏氨酸、丙氨酸
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缬氨酸、丙氨酸
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丝氨酸和丙氨酸
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亮氨酸。2.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述人、人源化或嵌合免疫球蛋白重链可变域包含N末端序列丙氨酸
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脯氨酸。3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中，所述多肽包含所述人、人源化或嵌合免疫球蛋白重链可变域的N末端氨基酸上游的信号肽。4.一种抗体、抗体变体或抗体片段，包含根据权利要求1或2所述的多肽。5.一种编码根据权利要求1至4中任一项所述的多肽、抗体、抗体变体或抗体片段的核酸，任选地其中，所述核酸在载体或噬菌体内。6.一种文库，包含至少约106个不同的根据权利要求5所述的核酸、载体或噬菌体。7.一种同时扩增和修饰编码人、人源化或嵌合免疫球蛋白重链可变域的核酸的方法，所述方法包括：(a)提供编码人、人源化或嵌合免疫球蛋白重链可变域的核酸；和(b)使用至少一个5
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引物、至少一个3
’
引物和所述核酸进行聚合酶链反应以产生扩增的核酸，其中，所述至少一个5
’
引物包含具有在所述扩增的核酸中引入修饰的修饰位点的核酸，从而所述扩增的核酸编码人、人源化或嵌合免疫球蛋白重链可变域，所述人、人源化或嵌合免疫球蛋白重链可变域包含选自由下述组成的组的N末端氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。8.根据权利要求7所述的方法，其中，每个扩增的核酸编码包含N末端丙氨酸的人、人源化或嵌合免疫球蛋白重链可变域，任选地其中，每个扩增的核酸编码包含N末端序列丙氨酸
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脯氨酸的人、人源化或嵌合免疫球蛋白重链可变域。9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，所述至少一个5
’
引物编码所述修饰位点的上游的信号肽或信号肽的一部分。10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中，步骤(a)中的所述核酸是cDNA；任选地其中，所述方法包括从动物的B细胞提取核酸以及从所述核酸产生cDNA以产生步骤(a)中提供的所述核酸的在先步骤；进一步任选地其中i)用目标抗原使所述动物免疫，并且来自所述B细胞的核酸编码对于所述目标抗原具有特异性和亲和性的重链；和/或ii)所述动物是包含人免疫球蛋白重链基因座的转基因鼠科动物；和/或iii)所述动物是包含共有轻链的转基因鼠科动物。11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其中，步骤(a)包括提供由至少一种重组人基因节段编码或基于至少一种重组人基因节段的多个不同核酸，所述基因节段选自以下人基因家族中的每一个：IGHV1、IGHV2、IGHV3、IGHV4、IGHV5、IGHV6和IGHV7。12.根据权利要求7至11中任一项所述的方法，其中，所述方法包括：
(a)使用选自1308AP、1308AP2、2020AP2、2018AP或2018AP2的5
’
引物扩增和修饰由IGHV1家族基因编码的核酸；和/或(b)使用选自1310AP2、1310AP3、1310AP4或1310AP5的5
’
引物扩增和修饰由IGHV2家族基因编码的核酸；和/或(c)使用选自0508AP、0508AP2、2018AP、2018AP2、2021AP、2021AP2、2021AP3...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得，
申请(专利权)人：美勒斯公司，
类型：发明
国别省市：