Δ12脂肪酸去饱和酶及其编码基因和在防治烟粉虱中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种昆虫Δ12脂肪酸去饱和酶，其编码基因为BtFAD2

【技术实现步骤摘要】
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12脂肪酸去饱和酶及其编码基因和在防治烟粉虱中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及烟粉虱Δ12脂肪酸去饱和酶及其编码基因，和在防治烟粉虱中的应用，更具体涉及特异性dsRNA以及转基因表达特异性dsRNA的植物在防控烟粉虱中的应用。

技术介绍

[0002]世界性农业害虫烟粉虱(Bemisia tabaci)可以危害数百种农业作物，在全球九十多个地区都报导了它的危害，造成数亿元的经济损失。烟粉虱分布范围广，繁殖能力强，目前田间针对烟粉虱最常用的防治手段依然是化学农药。化学农药的长期施加和不规范使用导致烟粉虱迅速对其产生了抗药性，使得田间烟粉虱的危害越发的猖獗。这也逐渐成为农业生产应用上的难题，为此农业生产生活亟需一个绿色安全的可持续的烟粉虱防治策略。
[0003]RNAi可以通过特定的双链RNA (dsRNA)影响昆虫的许多特征，如昆虫发育、免疫和行为过程。目前在多种病虫害管理策略中已利用RNAi降低病虫害对农药的抗性或损害病虫害的发育过程。由于具有具有高效、绿色特征，利用RNAi防治农业害虫手段是当前开发新型绿色害虫防治技术的热点。由于RNAi针对关键靶基因的特点，得到防治效果强、物种特异性高的生物靶基因是研发以RNAi技术为核心的防治农业害虫的必需条件。
[0004]多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids，PUFA)是生物体重要的营养物质之一。PUFA是生物体膜结构的重要组成部分，除此之外，研究表明它参与了植物的抗逆性，昆虫生殖等生理代谢过程。而缺乏足够的PUFA会对生命体生长发育产生不利的影响。FAD2基因即编码一种Δ12去饱和酶，该基因主要参与脂肪酸生物合成并在PUFA的生物合成的过程中发挥了关键作用。由于缺乏必要的Δ12去饱和酶，人类等高等生物无法独立合成结构复杂的PUFA，只能通过膳食等方式获取足够的PUFA营养。烟粉虱通过水平基因转移的方式获得了植物的Δ12去饱和酶基因BtFAD2
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9。因此，以烟粉虱的BtFAD2
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9基因为靶标，利用RNAi手段抑制该基因在烟粉虱中的表达，破坏烟粉虱PUFA生物合成平衡，从而实现对烟粉虱的可持续有效防控，为烟粉虱绿色防控技术提供新方法并具有广泛的商业应用前景。

技术实现思路

[0005]基于本实验前期烟粉虱基因组与转录组测序工作，本专利技术人在烟粉虱中发现一个Δ12去饱和酶基因(BtFAD2
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9)。由于BtFAD2
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9基因所编码的Δ12去饱和酶为PUFA生物合成的关键酶，在其他昆虫和哺乳动物并不存在，并且在与植物FAD2保持较高的氨基酸同源性和相近的进化关系，推测其为植物源水平转移基因。为了验证该基因在烟粉虱中的功能，首先克隆了BtFAD2
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9基因的全长序列，利用qPCR技术检测后发现，该基因在烟粉虱成虫中的表达了显著高于其它生长时期。本专利技术为一种利用烟粉虱PUFA营养合成关键基因BtFAD2
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9进行烟粉虱害虫防治的技术，为烟粉虱绿色防治提供了理论基础。
[0006]因此，本专利技术提供烟粉虱Δ12去饱和酶基因BtFAD2
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9，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。其获得方法如下：(1)利用烟粉虱基因组注释信息，分析烟粉虱脂肪酸合成路径。鉴定
到预测的植物源Δ12去饱和酶基因BtFAD2
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9；(2)利用实验室转录组数据库，对基因序列进行校正；(3)利用引物设计软件进行特异性的引物设计。克隆并测序获得BtFAD2
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9基因编码区序列。该序列包含一个1146bp的开放阅读框(ORF)，编码381个氨基酸的蛋白，其编码蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]本专利技术还提供了沉默烟粉虱Δ12去饱和酶基因BtFAD2
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9的dsRNA，包含Δ12去饱和酶基因BtFAD2
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9的片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)。其获得方法如下：(1)根据核苷酸序列SEQ ID NO.1设计5
′
端带有T7启动子序列的特异引物；(2)以烟粉虱成虫的cDNA为模板，利用特异性引物PCR扩增；(3)将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物；(4)通过T7 RibomaxTM Express RNAi System(Promega,Madison,WI,USA)试剂盒合成dsRNA。
[0008]基于上述dsRNA合成方案，本专利技术还提供一种dsRNA(由SEQ ID NO.3合成)在烟粉虱防治中的应用：饲喂烟粉虱该特异性dsRNA，结果显示，该dsRNA可以特异性地沉默烟粉虱Δ12去饱和酶基因BtFAD2
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9的mRNA表达，并导致烟粉虱成虫产卵量显著下降。由此可见，该dsRNA可以用于烟粉虱防治。
[0009]基于上述饲喂RNAi实验的结果，本专利技术还提供了利用烟粉虱Δ12去饱和酶基因的dsRNA构建沉默烟粉虱Δ12去饱和酶基因的转基因植物。所选取的植物优选为农作物，如番茄、烟草、棉花等。其获得方法如下：(1)根据核苷酸序列SEQ ID NO.1设计5
′
端特异引物；(2)以烟粉虱成虫的cDNA为模板，利用特异性引物PCR扩增；(3)将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物，回收PCR产物；(4)利用特异性的核酸内切酶将植物RNAi表达载体修饰；(5)通过In
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fusion连接酶将目的PCR产物连接至植物RNAi表达载体上；(5)将构建好的RNAi表达载体转入农杆菌中；(6)利用上述农杆菌侵染烟草，构建表达dsBtFAD2
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9的转基因烟草。本专利技术的目的在于提供了上述的序列、各种载体、转基因植物等应用于烟粉虱的防治。
[0010]本专利技术通过饲喂dsRNA发现烟粉虱关键营养合成基因BtFAD2
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9的特异性dsRNA可以导致烟粉虱生殖能力显著下降，从而证明BtFAD2
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9的特异性dsRNA可以作为烟粉虱田间害虫治理的分子靶标。我们以转基因烟草实验证明了转基因技术抑制烟粉虱中该基因的表达并减少烟粉虱产卵量，从而有效控制烟粉虱种群增长，达到田间烟粉虱治理的可行性。因此，基于烟粉虱关键生理功能基因BtFAD2
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9的转基因RNAi技术是一种烟粉虱防治新策略，它具有良好的商业价值和应用前景。总结来说，本专利技术具有以下有益效果如下：
[0011]本专利技术首次发现并证实了特异性干扰害虫靶标基因BtFAD2
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9，对高等动物和人类安全；其杀虫具有专一性，对非靶标生物安全，环境友好，无污染。因此，本专利技术相对于传统的害虫防治方法具有明显的技术优势。
附图说明
[0012]图1：为烟粉虱Δ12去饱和酶BtFAD2
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9跨膜结构域示意图。BtFAD2
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9共有6个跨膜区本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种昆虫Δ12脂肪酸去饱和酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述昆虫Δ12脂肪酸去饱和酶的编码基因。3. 根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4. 如权利要求3所述的基因序列，其特征在于：它是由特异性正向引物SEQ ID NO.4和反向引物 SEQ ID NO.5扩增得到的PCR产物纯化后得到，它的基因表达量由特异性正向引物SEQ ID NO.6和反向引物 SEQ ID NO.7通过qPCR检测。5. 一种昆虫Δ12脂肪酸去饱和酶基因的基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。6. 一种dsRNA，其特征在于：其是与SEQ ID NO.1所述的基因区段具有互补性，并以如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列为靶标设计。7. 如权利要求5所述的dsRNA，其特征在于：它是由含有23
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【专利技术属性】
技术研发人员：张友军，龚成，郭兆将，胡媛，杨泽众，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：