化学品植物代谢物整体毒性测试方法技术

本发明专利技术化学品植物代谢物整体毒性测试方法，该方法结合植物愈伤组织水培实验、动物细胞体外毒性实验获得化学品整体植物代谢产物的毒性，具体步骤为：1）通过动物细胞预培养确定植物愈伤组织暴露化学品浓度；2）植物愈伤组织暴露于化学品；3）提取化学品的整体植物代谢产物；4）动物细胞暴露整体代谢产物，进行细胞的染毒暴露及培养，培养结束后进行细胞活性检测，得到化学品植物整体代谢产物的毒性。本发明专利技术方法为化学品植物代谢产物的整体毒性测试提供了一种快速、高效的方法，能更全面评估化学品的环境风险和健康风险,对维护环境安全和人民健康来说具有重要的现实意义。人民健康来说具有重要的现实意义。人民健康来说具有重要的现实意义。

【技术实现步骤摘要】
化学品植物代谢物整体毒性测试方法


[0001]本专利技术属于化学品风险管控
，具体涉及一种化学品植物代谢物整体毒性测试方法。

技术介绍

[0002]释放到环境中的化学品可通过根系吸收进入植物体，随后通过食物链传递方式进入动物或人体内，可对机体消化系统、神经系统、呼吸系统、生殖系统和内分泌系统等造成损害，具有不可忽视的环境风险和人体暴露风险。例如，新烟碱类农药赋存在果蔬等可食用植物中，对人体产生膳食暴露风险，可致人体体重减少、肝肥大、性早熟等；邻苯二甲酸酯类在农作物中被频繁检出，饮食被认为是人体暴露邻苯二甲酸酯最主要的途径，由此诱导的内分泌干扰效应不容忽视。近些年，除化学品母体的健康风险，其代谢产物对生物体的负面影响也得到了逐渐关注。例如，现已研究表明四溴双酚A(TBBPA)的脱溴产物已被证实其水生毒性远远高于TBBPA；双酚A的O
‑
甲基化代谢产物较母体而言，对斑马鱼胚胎的毒性更强。
[0003]然而，现有的研究多数关注于化学品母体或少数化学品代谢物的毒性，忽略了化学品整体植物代谢产物的暴露风险。由于化学品的植物代谢产物复杂多样，难以实现所有代谢产物的准确鉴别和分离，阻碍了化学品整体植物代谢产物暴露风险的全面精准评价。基于此，本专利技术提出一种化学品植物代谢物整体毒性测试方法，可以方便快速检测植物整体代谢产物的毒性，为化学品的环境安全和健康风险评价提供新数据,对维护环境安全和人民健康具有重要意义。

技术实现思路

[0004]针对上述
技术介绍
中存在的问题，本专利技术设计的目的在于提供一种化学品植物代谢物整体毒性测试方法。
[0005]具体通过以下技术方案加以实现：
[0006]化学品植物代谢物整体毒性测试方法，方法结合植物愈伤组织水培实验、动物细胞体外毒性实验获得化学品整体植物代谢产物的毒性，具体步骤为：
[0007]1)通过动物细胞预培养确定植物愈伤组织暴露化学品浓度；
[0008]2)植物愈伤组织暴露于化学品；
[0009]3)提取化学品的整体植物代谢产物；
[0010]4)动物细胞暴露整体代谢产物，进行细胞的染毒暴露及培养，培养结束后进行细胞活性检测，得到化学品植物整体代谢产物的毒性。
[0011]进一步地，步骤1)中，动物细胞预培养是指利用动物细胞暴露化学品得到化学品在该动物细胞中的半致死浓度LC50。
[0012]进一步地，步骤2)中，植物愈伤组织暴露于化学品，暴露浓度设为LC50。
[0013]进一步地，步骤3)中，提取化学品的整体植物代谢产物的具体步骤为：
[0014]1)利用有机溶剂通过常规提取方式提取植物愈伤组织中化学品的整体代谢产物；
[0015]2)提取物高速离心后，收集有机层上清液；
[0016]3)通过氮吹、旋蒸的方式进行浓缩，制得浓缩物；
[0017]4)采用含0.3％二甲基亚砜的细胞培养液对浓缩物进行复溶。
[0018]进一步地，步骤4)中，细胞活性检测采用MTT法、XTT法、WST
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1法或CCK法来检测细胞活性，以评价化学品整体植物代谢产物的毒性。进一步地，所述动物细胞包括但不仅限于Caco
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2细胞、CHO
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K1细胞、Vero细胞、Hela细胞。
[0019]进一步地，所述化学品为所有可被植物吸收代谢的化学品，包括但不仅限于农药、溴代阻燃剂、双酚类物质、邻苯二甲酸酯类物质。
[0020]本专利技术方法为化学品植物代谢产物的整体毒性测试提供了一种快速、高效的方法，能更全面评估化学品的环境风险和健康风险,对维护环境安全和人民健康来说具有重要的现实意义。
附图说明
[0021]图1为实施例中四种三唑类农药的半数致死浓度LC50拟合曲线图；
[0022]图2为实施例中四种三唑类农药植物整体代谢产物的毒性变化图。
具体实施方式
[0023]以下结合具体实施例对本专利技术做进一步详细描述，以便更好地理解本技术方案。
[0024]化学品植物代谢物整体毒性测试方法，具体包括以下步骤：
[0025]1)植物愈伤组织暴露化学品浓度确定：将化学品配制成浓度不同的染毒液，动物细胞在96孔细胞培养板中暴露农药。培养动物细胞观察到细胞贴壁生长。根据实验加入不同浓度的染毒液，每组3个平行，含有0.3％二甲基亚砜(DMSO)的细胞培养液作为空白对照。进行细胞活性的检测，将细胞活性的曲线用GraphPad 6.0软件Hill函数拟合得到细胞毒性LC50。
[0026]2)细胞活性测定：从培养箱中取出已经染毒完成的96孔细胞培养板，吸去染毒液，利用MTT法、XTT法、WST
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1法、CCK法等方法检测细胞活性。
[0027]3)植物愈伤组织暴露化学品：得到化学品半数致死浓度LC50后，进行植物愈伤组织水培暴露实验，设置愈伤组织暴露组：10ml MS培养液+3g愈伤组织+化学品，空白组：10ml MS培养液+3g愈伤组织，不同化学品单独暴露，每组设置3个平行，暴露浓度设置为不同农药在动物细胞上的LC50，暴露时间为72h。暴露结束后，愈伤组织经冷冻干燥保存在
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20℃冰箱中，等待提取。
[0028]4)提取化学品的整体植物代谢产物：研磨成粉末的愈伤组织利用甲醇、乙腈、丙酮等有机溶剂，涡旋5
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10分钟，离心吸取有机层收集于塑料离心管中，用温和的氮气吹至净干，用含有DMSO的动物细胞培养基(DMSO含量为0.3％)定容至1ml。
[0029]5)动物细胞暴露整体代谢产物：培养动物细胞至动物细胞贴壁生长，根据实验设置实验组1(经植物愈伤组织暴露化学品的整体代谢产物+动物细胞)，实验组2(未经植物愈伤组织暴露的化学品母体+动物细胞)，空白组(培养基+动物细胞)。进行细胞的染毒暴露，置于37℃、5％ CO2培养箱培养24h后进行细胞活性的检测，得到化学品植物整体代谢产物毒性。
[0030]实施例
[0031]下面通过具体实施例进一步描述本专利技术。具体实施例选择Caco
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2细胞和生菜植物愈伤组织研究氟硅唑(Flusilazole)、烯唑醇(Diniconazol)、戊唑醇(Triadimefon)、丙环唑(Propiconazole)这四种三唑类农药的整体植物代谢物毒性，但本专利技术的保护范围并不仅限于此，具体实施方式如下：
[0032](1)确定生菜愈伤组织农药暴露浓度：将四种三唑类农药配制成浓度为5、10、20、30、50、80mg/L的染毒液，Caco
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2细胞在96孔细胞培养板中暴露农药。首先在每个孔中加入100μL Caco
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2细胞母液，放置于培养条件为37℃，CO2浓度5％的恒温培养箱中培养，24小时后观察到细胞贴壁生长。然后将Caco
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2细胞培养基吸除，根据实验加入不同浓度的染毒液，每组3个平行，含有0.3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.化学品植物代谢物整体毒性测试方法，其特征在于该方法结合植物愈伤组织水培实验、动物细胞体外毒性实验获得化学品整体植物代谢产物的毒性，具体步骤为：1）通过动物细胞预培养确定植物愈伤组织暴露化学品浓度；2）植物愈伤组织暴露于化学品；3）提取化学品的整体植物代谢产物；4）动物细胞暴露整体代谢产物，进行细胞的染毒暴露及培养，培养结束后进行细胞活性检测，得到化学品植物整体代谢产物的毒性。2.如权利要求1所述的化学品植物代谢物整体毒性测试方法，其特征在于步骤1）中，动物细胞预培养是指利用动物细胞暴露化学品得到化学品在该动物细胞中的半致死浓度LC50。3.如权利要求1所述的化学品植物代谢物整体毒性测试方法，其特征在于步骤2）中，植物愈伤组织暴露于化学品，暴露浓度设为LC50。4.如权利要求1所述的化学品植物代谢物整体毒性测试方法，其特征在于步骤3）中，提取化学品的整体植物代谢产物的具体步骤为：1）利用有机溶剂通...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙建强，朱千姿，周庆华，张安平，吴娟，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：