一种检测PBMC中SHP2抑制剂活性的试剂盒及其方法技术

本发明专利技术涉及一种检测PBMC中SHP2抑制剂活性的试剂盒及其方法，所述试剂盒中包括刺激剂GM

【技术实现步骤摘要】
一种检测PBMC中SHP2抑制剂活性的试剂盒及其方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及一种检测PBMC(外周血单个核细胞，Peripheral blood mononuclear cell)中SHP2抑制剂活性的试剂盒及其方法，具体涉及一种检测PBMC中SHP2抑制剂对ERK(细胞外信号调节激酶)磷酸化的抑制率的试剂盒及其方法。

技术介绍

[0002]SHP2全称是含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶，由基因PTPN11编码。SHP2磷酸酶活性受其自身构象变化而调控，基态时，N
‑
SH2结构域与PTP结构域结合并直接阻断其活性位点，保持自抑制构象；上游受体酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase，RTK)激活会触发上游信号因子上的pTyr残基与SHP2两个SH2结构域结合，使SHP2的构象发生改变，暴露PTP结构域上的活性位点，从而将SHP2从自抑制状态释放。SHP2作用于多种RTK下游，介导了RTK激活引起的下游RAS/MAPK信号通路的级联激活。SHP2参与蛋白质的去磷酸化后修饰，在多条控制癌症进程相关的信号通路中起到重要作用。细胞因子等和细胞膜表面的受体结合，诱导SHP
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2复合体的形成，进一步活化RAS
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RAF
‑
MEK
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ERK信号通路。另外，几乎所有受体酪氨酸激酶(RTK)以激活SHP2为主要途径、甚至是唯一途径来激活RAS。临床前研究表明，降低SHP2表达水平或抑制其磷酸酶活性能在多种癌细胞中显著抑制MAPK信号通路活性以及细胞增殖，尤其是在RTK依赖型或携带RAS通路特定突变(如KRASG12C突变，BRAFClass3突变，NF1失活突变等)的癌症中。此外，SHP2在T细胞中作用于PD
‑
1下游，介导了PD
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L1/PD
‑
1通路激活导致的肿瘤免疫抑制作用。因此，SHP2可通过调节多重机制促进肿瘤的发生发展，开发选择性的SHP2小分子抑制剂有望治疗多种癌症。
[0003]SHP2抑制剂一般用于癌症治疗中，因此其研究大多集中在在晚期实体瘤如非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌、胃肠道间质瘤和结直肠癌，在这些实体瘤中如何去方便的并且能够及时的监控SHP2抑制剂的药效成为了一个难点，因为临床上在不同的给药时间点获取新鲜的肿瘤组织是相对比较困难的，对于病人来频繁手术或穿刺说也是比较痛苦的。因此，研究人员普遍建议采用间接的方法比如抽取人外周血并分离单个核细胞，通过评价PBMC中ERK蛋白的磷酸化的水平来间接评估SHP2抑制剂的效果。
[0004]然而，由于实体瘤中，人外周血PBMC相对于癌组织来说属于一个正常的组织，而正常的PBMC中的ERK的磷酸化水平是极低的，基本上低于目前的很多检测手段所能达到的检测限。
[0005]因此，如何实现对PBMC中SHP2抑制剂活性进行准确评价，从而在不手术或穿刺取肿瘤组织的情况下，去方便并且能够及时的监控SHP2抑制剂的药效，仍是本领域技术人员亟待解决的问题，

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种检测PBMC中SHP2抑制剂活性的
试剂盒及其方法，具体提供一种检测PBMC中SHP2抑制剂对ERK磷酸化的抑制率的试剂盒及其方法。
[0007]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种检测PBMC中SHP2抑制剂活性的试剂盒，所述试剂盒中包括刺激剂GM
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CSF(粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子)和检测总ERK及磷酸化ERK的试剂。
[0009]本专利技术创造性地发现刺激剂GM
‑
CSF能够显著提高PBMC中ERK磷酸化的本底信号，同时使SHP2抑制剂对这种信号敏感，从而进行充分抑制，这样通过比较给药前后的信号值变化，来评估SHP2抑制剂对ERK磷酸化的抑制率，从而间接来评价其药效。
[0010]第二方面，本专利技术提供一种检测PBMC中SHP2抑制剂活性的方法，所述方法包括利用如第一方面所述的试剂盒进行检测，具体包括如下步骤：
[0011]将PBMC待测样本与刺激剂GM
‑
CSF混合，孵育后，离心，收集PBMC细胞沉淀，裂解后，检测裂解液中ERK总信号值及磷酸化ERK的信号值，计算磷酸化ERK的占比；
[0012]对不含有SHP2抑制剂的PBMC对照样本进行与上述PBMC待测样本同样的操作；
[0013]根据待测样本与对照样本的检测结果，计算得到SHP2抑制剂对ERK磷酸化的抑制率，抑制率越高说明待测样本中SHP2抑制剂的活性越强。
[0014]优选地，所述混合得到的体系中，PBMC与GM
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CSF的比例为(0.5
‑
5)
×
107个细胞/(1
‑
100)ng。
[0015]上述(0.5
‑
5)
×
107个细胞中的具体数值例如5
×
106个细胞、8
×
106个细胞、1
×
107个细胞、1
×
107个细胞、1.5
×
107个细胞、2
×
107个细胞、2.5
×
107个细胞、3
×
107个细胞、3.5
×
107个细胞、4
×
107个细胞、4.5
×
107个细胞、5
×
107个细胞等。
[0016]上述(1
‑
100)ng中的具体数值例如1ng、5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng等。
[0017]优选地，所述混合得到的体系中，PBMC与GM
‑
CSF的比例为(2
‑
5)
×
107个细胞/(10
‑
100)ng。
[0018]优选地，所述孵育的温度为10
‑
30℃，例如10℃、15℃、20℃、25℃、30℃等。
[0019]优选地，所述孵育的时间为3
‑
8min，例如3min、3.5min、4min、4.5min、5min、5.5min、6min、6.5min、7min、7.5min、8min等。
[0020]孵育时间可选择上述范围内的数值，如果再过长，信号值会出现衰减，时间过短会导致信号值刺激不起来。
[0021]优选地，所述离心的速度为300
‑
800g，例如300g、350g、400g、450g、500g、550g、600g、650g、700g、750g、800g等，时间为1
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测PBMC中SHP2抑制剂活性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括刺激剂GM
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CSF和检测总ERK及磷酸化ERK的试剂。2.一种检测PBMC中SHP2抑制剂活性的方法，其特征在于，所述方法包括利用如权利要求1所述的试剂盒进行检测，具体包括如下步骤：将PBMC待测样本与刺激剂GM
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CSF混合，孵育后，离心，收集PBMC细胞沉淀，裂解后，检测裂解液中ERK总信号值及磷酸化ERK的信号值，计算磷酸化ERK的占比；对不含有SHP2抑制剂的PBMC对照样本进行与上述PBMC待测样本同样的操作；根据待测样本与对照样本的检测结果，计算得到SHP2抑制剂对ERK磷酸化的抑制率，抑制率越高说明待测样本中SHP2抑制剂的活性越强。3.如权利要求2所述的检测PBMC中SHP2抑制剂活性的方法，其特征在于，所述混合得到的体系中，PBMC与GM
‑
CSF的比例为(0.5
‑
5)
×
107个细胞/(1
‑
100)ng。4.如权利要求3所述的检测PBMC中SHP2抑制剂活性的方法，其特征在于，所述混合得到的体系中，PBMC与GM
‑
CSF的比例为(2
‑
5)
×
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李强，王丛，张亚飞，
申请(专利权)人：迈杰转化医学研究苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：