一种基于细胞模型中NO信号通路筛选皮肤舒缓原料的试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种皮肤舒缓原料的筛选方法及试剂盒,所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2,所述试剂R1含有:NO标准试剂、Lysis Buffer、羟胺溶液；所述试剂R2含有：氨基苯磺酸显色液、萘胺显色液。同时,本发明专利技术也公开了利用该试剂盒进行皮肤舒缓原料的筛选以及化妆品舒缓功效评价的检测方法。本发明专利技术的试剂盒和检测方法具有操作简单方便、时间短、灵敏度高、应用范围广等优点，可快速、科学、高通量的筛选实验样品,加快化妆品相关企业的研发进程。同时为化妆品相关企业和消费者挑选安全的化妆品原料和化妆品提供更多的评价选择。妆品提供更多的评价选择。

【技术实现步骤摘要】
一种基于细胞模型中NO信号通路筛选皮肤舒缓原料的试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于生物化学和细胞生物学
，涉及一种基于细胞模型中NO信号通路的试剂盒，利用该试剂盒进行皮肤舒缓原料的筛选以及化妆品舒缓功效评价的检测方法。

技术介绍

[0002]为贯彻落实《化妆品监督管理条例》，规范和指导化妆品功效宣称评价工作，国家药监局组织起草了《化妆品功效宣称评价规范》(以下称《规范》)，已经公布，自2021年5月1日起施行。根据《化妆品监督管理条例》等相关法律法规要求,化妆品注册人、备案人应当按照《规范》要求，对化妆品的功效宣称进行评价，并上传产品功效宣称依据的摘要，其中包括文献资料调研、研究数据分析或者化妆品功效宣称评价试验等。
[0003]皮肤过敏及炎症是皮肤刺激的主要类型之一,缓解炎症的发生可以有效缓解皮肤刺激。化妆品功效中提到的舒缓是指有助于改善皮肤刺激等状态。目前,化妆品行业引入生物化学、细胞生物学、皮肤医学等技术,采用权威仪器辅助检测功效指标。化妆品相关的协会机构也致力于推行功效检测方法标准,以推动整个行业规范化发展。
[0004]但目前，还未有可靠的、方便的方法来评价舒缓效果。

技术实现思路

[0005]本专利技术的主要目的，在于提供一种皮肤舒缓原料的筛选方法，包括如下步骤：
[0006]1)复苏液氮冻存的RAW264.7细胞，进行至少两次传代培养；
[0007]将LPS称重，溶解，配制1mg/mL水溶液，0.22μm滤膜过滤，部分以生理盐水或者PBS稀释为100μg/mL备用，其余原浓度
‑
20℃保存储存备用；
[0008]2)将复苏并经过传代培养的细胞消化下来；收集的细胞悬液，1500rpm离心10min；根据样本数量计算需要的细胞数量及细胞悬液体积，假设样本数为N，另外加空白对照组、阴性组和阳性组，共需N+3组，每组3个平行；48孔板每孔添加细胞悬液200μL，含细胞数量为5
‑
10万个细胞/孔；
[0009]3)弃去上清，向离心管中加入培养液，调整细胞浓度；37℃，5％ CO2培养箱中培养过夜14
±
2h；
[0010]4)弃去培养液，200μL/孔生理盐水或PBS溶液清洗细胞；空白组和阴性组每孔加入195μL培养基+5μL生理盐水或PBS溶液，样品组每孔加入193μL细胞培养+2μL的LPS工作液+5μL待检测样品；
[0011]37℃，5％ CO2条件下孵育培养24h；
[0012]将200μL的细胞培养上清收集于无菌EP管中，即收即检；
[0013]5)取20μL待测溶液，加入30μL试剂R1，混匀，反应10分钟；反应后液体加入50μL试剂R2，混匀，反应5分钟；将96孔板放入酶标仪中，检测OD540的值；所述试剂R1含有:NO标准
试剂、Lysis Buffer、羟胺溶液；所述试剂R2含有：氨基苯磺酸显色液和萘胺显色液；
[0014]同时，以试剂盒标准品的NO标准物质的浓度和OD540为横纵坐标绘制标准曲线，计算出标准曲线的回归方程式；
[0015]用酶标仪540nm波长下测定的光密度值(OD)，根据标准曲线的回归方程式计算NO的含量；
[0016]NO相对含量(％)＝OD
样品
/OD
NC
×
100％
[0017]式中，OD
样品
指样品组的OD值均值，OD
NC
为模型对照组(NC组)的OD值均值；
[0018]NO相对抑制率(％)＝(OD
NC
‑
OD
样品
)/OD
NC
×
100％
[0019]式中，OD
样品
指样品组的OD值平均值，OD
NC
为模型对照组(NC组)的OD值平均值；
[0020]在试验满足有效性验证的基础上，受试物与NC组相比，NO抑制率≥10％，且样品组的NO相对含量与NC组相比，具有显著性差异(P<0.05)，说明受试物在该受试浓度下，具有抑制巨噬细胞释放NO的能力，可作为皮肤舒缓原料。
[0021]在本专利技术的优选实施例中，步骤1)中，传代培养的细胞接种密度为在相同培养容器长满的细胞数量的40％
‑
50％，以保证最多48h后可铺板进行实验。
[0022]在本专利技术的优选实施例中，步骤3)中，细胞浓度为96孔板接种1
‑
5万个细胞/孔；48孔板接种约5
‑
10万个细胞/孔。
[0023]在本专利技术的优选实施例中，步骤4)所述的样品包括动物样品、植物样品或微生物样品，或动物的代谢物样品、植物的代谢物样品、微生物的代谢物样品。
[0024]在本专利技术的优选实施例中，所述的样品为植物样品，所述植物样品处理如下：取正常或逆境下的新鲜植物组织，清洗干净，干燥，切碎；称取植物样品1
‑
1.5g，加入2ml Lysis buffer后，冰浴条件下研磨，研磨完成后，4℃10000g离心10min，取上清液4℃保存备用。
[0025]在本专利技术的优选实施例中，步骤4)的R1试剂中，按质量比，羟胺溶液的浓度为0.1％～2％；氨基苯磺酸显色液浓度为0.01％～0.8％；萘胺显色液浓度为0.01％～1.0％。
[0026]本专利技术的另一目的在于提供化妆品舒缓功效评价方法，在试验满足有效性验证的基础上，受试物与NC组相比，NO抑制率≥10％，且样品组的NO相对含量与NC组相比，具有显著性差异(P<0.05)，说明受试化妆品在该受试浓度下，具有抑制巨噬细胞释放NO的能力，具有舒缓功效。
[0027]本专利技术的再一目的，在于提供筛选皮肤舒缓原料的试剂盒，其包括试剂R1和试剂R2,其中，所述试剂R1含有:NO标准试剂、Lysis Buffer、羟胺溶液；所述试剂R2含有：氨基苯磺酸显色液和萘胺显色液。
[0028]本专利技术所述的术语“NO标准试剂”是指一氧化氮标准试剂，其成分为亚硝酸钠，化学式为NaNO2。一氧化氮标准试剂配置方法：
[0029]1、标准储备液
[0030]称取亚硝酸钠标准品69mg，精确至0.0001g，置于10mL棕色容量瓶中，以纯水定容，混匀并使之溶解。此溶液浓度为100m mol/L，置于2
‑
4℃保存。保存时间为1个月。
[0031]2、标准工作溶液
[0032]移取上述标准贮备液适量，以纯水稀释配制标准工作系列溶液，浓度分别为1m mol/L、5m mol/L、10m mol/L、50m mol/L、100m mol/L。
[0033]在本专利技术的优选实施例中，按质量比，羟胺溶液的浓度为0.1％～2％；氨基苯磺酸
显色液浓度为0.01％～0.8％；萘胺显色液浓度为0.01％～1.0％。
[0034]本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种皮肤舒缓原料的筛选方法，包括如下步骤：1)复苏液氮冻存的RAW264.7细胞，进行至少两次传代培养；将LPS称重，溶解，配制1mg/mL水溶液，0.22μm滤膜过滤，部分以生理盐水或者PBS稀释为100μg/mL备用，其余原浓度
‑
20℃保存储存备用；2)将复苏并经过传代培养的细胞消化下来；收集的细胞悬液，1500rpm离心10min；根据样本数量计算需要的细胞数量及细胞悬液体积，假设样本数为N，另外加空白对照组、阴性组和阳性组，共需N+3组，每组3个平行；48孔板每孔添加细胞悬液200μL，含细胞数量为5
‑
10万个细胞/孔；3)弃去上清，向离心管中加入培养液，调整细胞浓度；37℃，5％CO2培养箱中培养过夜14
±
2h；4)弃去培养液，200μL/孔生理盐水或PBS溶液清洗细胞；空白组和阴性组每孔加入195μL培养基+5μL生理盐水或PBS溶液，样品组每孔加入193μL细胞培养+2μL的LPS工作液+5μL待检测样品；37℃，5％CO2条件下孵育培养24h；将200μL的细胞培养上清收集于无菌EP管中，即收即检；5)取20μL待测溶液，加入30μL试剂R1，混匀，反应10分钟；反应后液体加入50μL试剂R2，混匀，反应5分钟；将96孔板放入酶标仪中，检测OD540的值；所述试剂R1含有:NO标准试剂、Lysis Buffer、羟胺溶液；所述试剂R2含有：氨基苯磺酸显色液和萘胺显色液；同时，以试剂盒标准品的NO标准物质的浓度和OD540为横纵坐标绘制标准曲线，计算出标准曲线的回归方程式；用酶标仪540nm波长下测定的光密度值(OD)，根据标准曲线的回归方程式计算NO的含量；NO相对含量(％)＝OD
样品
/OD
NC
×
100％式中，OD
样品
指样品组的OD值均值，OD
NC
为模型对照组即NC组的OD值均值；NO相对抑制率(％)＝(OD
NC
‑
OD
样品
)/OD
NC
×
100％式中，OD
样品
指样品组的OD值平均值，OD
NC
为模型对照组即NC组的OD值平均值；在试验满足有效性验证的基础上，受试物与NC组相比，NO抑制率≥10％，且样品组的NO相对含量与NC组相比，具有显著性差异(P<0.05)，说明受试物在该受试浓度下，具有抑制巨噬细胞释放NO的能力，可作为皮肤舒缓原料。2.如权利要求1所述的皮肤舒缓原料的筛选方法，其特征在于，步骤1)中，传代培养的细胞接种密度为在相同培养容器长满的细胞数量的40％
‑
50％，以保证最多48h后可铺板进行实验。3.如权利要求1所述的皮肤舒缓原料的筛选方法，其特征在于，步骤3)中，细胞浓度为96孔板接种1
‑
5万个细胞/孔；48孔板接种约5
‑
10万个细胞/孔。4.如权利要求1所述的皮肤舒缓原料的筛选方法，其特征在于，步骤4)所述的样品包括动物样品、植物样品或微生物样品，或动物的代谢物样品、植物的代谢物样品、微生物的代谢物样品。5.如权利要求4所述的皮肤舒缓原料的筛选方法，其特征在于，所述的样品为植物样品，所述植物样品处理如下：取正常或逆境下的新鲜植物组织，清洗干净，干燥，切碎；称取
植物样品1
‑
1.5g，加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾念泽，杨俊武，吴静娴，
申请(专利权)人：福建中妆技术研究有限公司，
类型：发明
国别省市：