膀胱类器官及其制造方法技术

本发明专利技术的一个目的在于，提供用于制造具有膀胱那样的膀胱上皮细胞类型的层结构的膀胱类器官的腹侧后肠类器官。本发明专利技术的一个方式提供一种制造腹侧后肠类器官的方法，其包括下述步骤：将多能干细胞用含有激活素A和GSK3β抑制剂的诱导培养基A进行培养而分化诱导为胚胎内胚层细胞；以及将上述胚胎内胚层细胞用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂且可以还含有骨形成蛋白的诱导培养基B进行培养，接着，在胞外基质存在下用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂且可以还含有骨形成蛋白的诱导培养基B进行培养，形成腹侧后肠类器官。形成腹侧后肠类器官。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】膀胱类器官及其制造方法


[0001]本公开涉及腹侧后肠类器官或膀胱类器官、或者它们的制造方法。本公开另外涉及在其肾脏或膀胱或者它们的周边部位具有腹侧后肠类器官或膀胱类器官的非人哺乳动物、或其制造方法。本公开还涉及评价腹侧后肠类器官、膀胱类器官或上述非人哺乳动物对受试物质的药物应答性的方法。本公开还涉及含有腹侧后肠类器官或膀胱类器官的再生医疗用组合物。

技术介绍

[0002]已知膀胱为来源于胚胎内胚层(Definitive Endoderm)的器官，由位于原始消化管(Gut tube)最后方的后肠(Hindgut)经由腹侧泄殖腔(Ventral cloaca)发生。膀胱为暂时储存从肾脏经由输尿管输送来、经尿道排出的尿液的袋状器官。膀胱的蓄尿功能或排尿功能可因膀胱组织由于放射线治疗、膀胱破裂和糖尿病等受到损伤而下降或消失。
[0003]以使丧失功能的器官再生、治疗难治性疾病、或弥补器官移植中的长期供体不足为目标，正在进行再生医疗研究。再生医疗领域中，正在研究利用由ES细胞或iPS细胞等多能干细胞在试管内(体外)创造出的、被称为类器官的类似于器官的细胞集合体。
[0004]非专利文献1记载了通过在试管内培养小鼠ES细胞来分化诱导膀胱上皮。非专利文献2～4记载了通过在试管内培养人多能干细胞来分化诱导膀胱上皮。非专利文献5记载了：在试管内培养胶原蛋白基质中的小鼠ES细胞后，将其移植到小鼠肾被膜下，分化诱导膀胱上皮。
[0005]现有技术文献
[0006]非专利文献
[0007]非专利文献1：Mauney JR,et.al.,:All
‑
Trans Retinoic Acid Directs Urothelial Specification of Murine Embryonic Stem Cells via GATA4/6Signaling Mechanisms.PLoS One 2010,5:e11513.
[0008]非专利文献2：Osborn SL,et.al.,:Induction of human embryonic and induced pluripotent stem cells into urothelium.Stem Cells Transl Med2014,3:610
‑
9.
[0009]非专利文献3：Suzuki K,et.al.,:Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature stratified bladder urothelium.Sci Rep 2019,9:1
‑
13.
[0010]非专利文献4：Kang M,et.al.,:Generation of Bladder Urothelium from Human Pluripotent Stem Cells under Chemically Defined Serum
‑
and Feeder
‑
Free System.Int J Mol Sci 2014,15:7139
‑
7157.
[0011]非专利文献5：Oottamasathien S,et.al.,:Directed differentiation of embryonic stem cells into bladder tissue.Dev Biol 2007,304:556
‑
566.

技术实现思路

[0012]专利技术所要解决的问题
[0013]非专利文献1～4记载的向膀胱上皮的分化诱导并不是模仿实际的膀胱发生过程，另外也不是通过三维培养系统进行分化诱导。非专利文献1～4中分化诱导出的膀胱上皮类器官不具有膀胱那样的膀胱上皮细胞类型的层结构。非专利文献5中分化诱导出的膀胱上皮类器官是否具有膀胱那样的三层结构这一点是不清楚的。
[0014]本专利技术人对由多能干细胞形成膀胱类器官的条件进行了各种研究。例如，本专利技术人研究了构建模仿了实际的膀胱发生过程的三维培养系统的条件。本公开的一个目的在于，提供用于制造具有膀胱那样的膀胱上皮细胞类型的层结构的膀胱类器官的、新颖的腹侧后肠类器官或其制造方法。本公开的一个目的在于，提供具有膀胱那样的膀胱上皮细胞类型的层结构的新颖的膀胱类器官或其制造方法。本公开的一个目的在于，提供在其肾脏或膀胱或者它们的周边部位具有腹侧后肠类器官或膀胱类器官的新颖的非人哺乳动物、或其制造方法。本公开的一个目的在于，提供含有腹侧后肠类器官或膀胱类器官的新颖的再生医疗用组合物。本公开的一个目的在于，提供评价腹侧后肠类器官、膀胱类器官、或上述非人哺乳动物对受试物质的药物应答性的新颖的方法。
[0015]用于解决问题的方法
[0016]本公开提供以下的方案。
[0017][项A1]一种制造腹侧后肠类器官的方法，其包括下述步骤：将多能干细胞用含有激活素A和GSK3β抑制剂的诱导培养基A进行培养而分化诱导为胚胎内胚层细胞；将上述胚胎内胚层细胞用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂的诱导培养基B进行培养，接着，在胞外基质凝胶中用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂的诱导培养基B进行培养而形成后肠类器官；以及将上述后肠类器官在胞外基质凝胶中用含有成纤维细胞生长因子、GSK3β抑制剂和骨形成蛋白的诱导培养基b2进行培养而形成腹侧后肠类器官。
[0018][项A2]一种腹侧后肠类器官，其表达P63、CDX2、HOXA13和KRT8且不表达SOX2。
[0019][项A2
‑
1]一种腹侧后肠类器官，其表达P63、CDX2、HOXA13和KRT8且实质上不表达SOX2。
[0020][项A3]根据项A2所述的腹侧后肠类器官，其中，腹侧后肠类器官中的CDX2的表达量比后肠类器官中的CDX2的表达量少，或在腹侧后肠类器官中不表达CDX2。
[0021][项A3
‑
1]根据项A2所述的腹侧后肠类器官，其中，腹侧后肠类器官中的CDX2的表达量比后肠类器官中的CDX2的表达量少，或在腹侧后肠类器官中实质上不表达CDX2。
[0022][项A4]一种制造膀胱类器官的方法，其包括下述步骤：将通过项A1所述的方法制造的腹侧后肠类器官、或者项A2或项A3所述的腹侧后肠类器官在胞外基质凝胶中用含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和骨形成蛋白的诱导培养基C进行培养。
[0023][项A5]一种膀胱类器官，其包含：沿着上述膀胱类器官的最外周局部存在的、含有共表达P63和KRT5的细胞的第一细胞层；相对于上述第一细胞层在内侧方向局部存在的、含有共表达P63和UPK2的细胞的第二细胞层；以及相对于上述第二细胞层在内侧方向局部存在的、含有不表达P63但表达UPK2的细胞的第三细胞层。
[0024][项A5
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制造腹侧后肠类器官的方法，其包括下述步骤：将多能干细胞用含有激活素A和GSK3β抑制剂的诱导培养基A进行培养而分化诱导为胚胎内胚层细胞；以及将所述胚胎内胚层细胞用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂且还任选含有骨形成蛋白的诱导培养基B进行培养，接着，在胞外基质存在下用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂且还任选含有骨形成蛋白的诱导培养基B进行培养，形成腹侧后肠类器官。2.根据权利要求1所述的方法，其中，形成所述腹侧后肠类器官的步骤包括下述步骤：在用所述诱导培养基B培养所述胚胎内胚层细胞后，在胞外基质存在下用所述诱导培养基B进行培养而形成后肠类器官；以及将所述后肠类器官在胞外基质存在下用所述诱导培养基B进行培养而形成腹侧后肠类器官，用于形成后肠类器官的诱导培养基B含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂，用于形成腹侧后肠类器官的诱导培养基B含有成纤维细胞生长因子、GSK3β抑制剂和骨形成蛋白。3.根据权利要求1所述的方法，其中，用于形成腹侧后肠类器官的诱导培养基B含有成纤维细胞生长因子、GSK3β抑制剂和骨形成蛋白。4.一种腹侧后肠类器官，其通过权利要求1～3中任一项所述的方法而制造。5.一种腹侧后肠类器官，其表达作为腹侧后肠标志物的P63，表达HOXA13和CK8/KRT8，并且实质上不表达作为背侧后肠标志物的SOX2。6.一种腹侧后肠类器官，其是具有内腔的腹侧后肠类器官，其表达选自由P63、ΔN63、GATA3、ISL1和SATB2组成的组中的至少1种腹侧后肠标志物，表达选自由磷酸化Smad1/5/8、HOXA13、FOXA2、CK8/KRT8和ECAD组成的组中的至少1种标志物，并且实质上不表达选自由SOX2、T和CDX2组成的组中的至少1种背侧后肠标志物。7.一种制造膀胱类器官的方法，其包括下述步骤：将通过权利要求1～3中任一项所述的方法制造的腹侧后肠类器官或权利要求4～6中任一项所述的腹侧后肠类器官在胞外基质存在下用含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和骨形成蛋白的诱导培养基C进行培养；导入到人或非人哺乳动物的肾脏或膀胱或者它们的周边部位；或者在间充质干细胞或间充质细胞存在下进行培养。8.一种膀胱类器官，其通过权利要求7所述的方法而制造。9.一种膀胱类器官...

【专利技术属性】
技术研发人员：高里实，尾藤和浩，菲利普，
申请(专利权)人：大塚制药株式会社，
类型：发明
国别省市：